山药汁液中羟基磷灰石生物复合物的仿生合成

嵇明翔，谢安建，沈玉华

（安徽大学化学化工学院，安徽合肥230601）

山药汁液中羟基磷灰石生物复合物的仿生合成

嵇明翔，谢安建，沈玉华

（安徽大学化学化工学院，安徽合肥230601）

选用天然植物山药中富含的生物分子作为反应物和模板，在常温、常压下仿生制备了羟基磷灰石生物复合物。研究结果表明，在山药表面生成的是卵石状羟基磷灰石晶体，而山药榨汁液中生成复合物的形貌和晶型与构晶离子的添加顺序有关，分别出现了立方体晶态纳米颗粒和多孔疏松的无定型结构，可能归结于山药中可溶性与不可溶的生物分子所含不同极性基团在羟基磷灰石形成过程中起到的不同诱导和调控作用。

仿生合成；生物大分子；羟基磷灰石；山药；生物复合物

1　前言

自然界中的许多无机纳米材料，如珍珠、贝壳等，拥有特殊的形貌，且容易被生物体吸收和利用，具有极佳的生物适配性［1-3］。这些无机纳米材料的形成主要是通过利用生物体所分泌的具有特定结构和官能团的生物分子，例如氨基酸、蛋白质、多糖等，作为模板物质［4］，在常规条件下与无机离子相互作用，最终沉积而形成的［5］。因此利用生物矿化的机理，制备无机纳米材料不仅是一种绿色的合成方法，而且已成为材料、化学、生物、医学等多学科领域之间相互交叉的前沿课题［6-7］。

羟基磷灰石（Ca10（PO4）6（OH）2，HA）是生物体中骨骼和牙齿的主要无机材料成分，因其良好的生物相容性，被作为骨替代和骨修复材料［8］，也是目前最广泛应用于组织工程中并最得到普遍接受的组织修复材料。但由于HA其本身具有的脆性大，易断裂等缺点，在实际应用过程中受到了极大地限制［9］。于是，人们通过利用其它材料对HA进行改性，制备HA的复合材料，追求理想的使用效果。目前已有同蚕丝蛋白、壳聚糖和胶原蛋白等生物材料相互作用制备的复合材料［10-13］，但利用植物提取汁液中的可溶性生物分子和植物本身难溶性生物分子作为模板兼反应物、常温常压下仿生合成HA生物复合材料鲜见报道。

同时由于HA的强吸附性能和pH敏感性，用作为药物载体、用于药物的控制释放也得到人们的高度重视。如Yang［14］等人利用碳酸钙为模板，制备了空心介孔HA，将药物有效的负载于其内部，利用HA的pH敏感性缓释药物。而Qi［15］等人利用DNA分子为模板，制备片状HA，作为良好的药物载体。而使用植物提取汁液中的生物分子作模板制备具有多孔结构的HA用于药物载体材料也未见报道。

山药（Chinese yam），又称薯蓣，具有很高的营养价值。其汁液中内含丰富的植物蛋白、氨基酸，多糖等，还含有大量的皂苷成分，可以使得生成的产物有效分散在溶液中，不易聚结，且具有原料丰富、廉价易得的优势。因此，本文直接利用山药汁液与Ca2+-H2PO4--HPO42-体系反应，一步合成了HA生物复合物，并探索了离子添加顺序的不同对于HA最终复合产物的影响。还研究了山药表面不溶性生物大分子对羟基磷灰石诱导和调控作用。

2　实验部分

2.1试剂与仪器

无水氯化钙（CaCl2）、磷酸氢二钠（Na2HPO4）、磷酸二氢钠（NaH2PO4）均购自国药试剂有限公司，皆为分析纯；水为二次水；实验所用的山药购于安徽省合肥市九龙街菜市场。

红外光谱采用NEXUS-870 FTIR型傅里叶变换红外光谱仪检测，扫描范围为4000-400 cm-1；物相测试使用DX-2700型X射线衍射仪完成，测试电压为40 kV，电流100 mA，扫描速度为4°/min；产物的形貌在SU1510型扫描电子显微镜上观测，加速电压为10 kV；高分辨透射电镜对产物的晶格进行观察。

2.2山药榨汁液中HA的合成

取二次水洗净的去皮山药200 g，加200 mL二次水榨汁，过滤后离心（12000 r/min，5min）除去固体，取上清液。接着取30 mL榨汁液、依次加入30 mL CaCl2溶液（40 mmol/L）、18 mL Na2HPO4（24 mmol/L）+18 mL NaH2PO4（15.12 mmol/L）缓冲溶液，搅拌5 min后静置一天，将混合液离心，用无水乙醇洗涤固体产物三次，烘干后得到产物1。

对照试验1：实验方法同上，只是在30 mL榨汁液中，先加入18 mL Na2HPO4（24 mmol/L）+18 mL NaH2PO4（15.12 mmol/L）缓冲溶液，再加入30 mL CaCl2溶液（40 mmol/L），得到产物2。

对照试验2：取二次水洗净的去皮山药30 g，切割成小块，加入30 mL二次水中进行分散，然后加入构晶离子溶液，其加入的量和顺序以及制备方法同制备产物1。最后，用二次水洗涤反应后的山药若干次，得产物3，切片并做SEM分析。

3　结果与讨论

3.1产物的XRD谱图和高分辨透射电镜图片

图1在（a）纯水和（b）山药榨汁液中得到产物1的XRD图谱及（c）山药榨汁液中获得产物1的高分辨透射电镜图

图1a，b为在不同体系中所制备产物的XRD图谱。在纯水中生成产物的XRD图谱如图1a所示。可见样品在2θ为10.82°、25.86°、31.74°、34.05°、39.76°、46.66°、49.46°处出现较强或中等强度的衍射峰，分别对应HA的（100）、（201）、（211）、（202）、（130）、（222）、（230）晶面，与HA的标准卡相一致（JCPDS card No.09-0432），说明了HA的生成。图1b是在山药汁液中反应产物1的XRD图，其衍射峰对应位置与图1a相似，但峰的相对强度有变化，位于2θ为10.8°处的（100）晶面的峰大大增强，显示出HA在这个面上的定向生长得到了强化，易于形成立方体结构，表明山药汁液中多糖、蛋白等生物大分子起了诱导HA晶体取向生长的作用。另外还可以看到XRD图有宽化现象，推测可能是山药汁液中的生物分子与HA结合形成了复合物［16-17］。图1c为山药榨汁液中所得到产物1的高分辨透射电镜图，在选取的微区中可以发现晶格的间距为0.82 nm，与HA的（100）晶面的间距一致，符合XRD中HA的（100）晶面定向生长得到强化的结果。并可发现HA周围呈现无定型结构，可能是榨汁液中作为模板的有机生物分子，进一步说明HA生物复合物的成功制备。

3.2产物的FTIR谱图

图2（a）山药榨汁液、（b）山药榨汁液-Ca2+复合物溶液、（c）HA生物分子复合物和（d）HA的FTIR图谱

图2是不同样品的FTIR图谱。山药汁液的FTIR图谱见图2a，可以观察到位于1730 cm-1的复合物溶液中羧基中C=O伸缩振动峰、蛋白质酰胺I带（羰基的伸缩振动，1654 cm-1）、酰胺II带（N-H伸缩振动，1570 cm-1）和酰胺III带（C-N弯曲振动，1240 cm-1）［18］。还可以发现图中900-650 cm-1区域出现的N-H剪式振动吸收峰、位于2850-3000 cm-1处的C-H伸缩振动峰以及3500-3300 cm-1处的氢键特征吸收峰，表明山药汁液中主要的生物大分子是多糖、蛋白质等生物分子。图2b是山药榨汁液-Ca2+复合物溶液的FTIR图谱。可以观察到，在山药汁液中加入Ca2+溶液后，位于1730 cm-1的复合物溶液中C=O伸缩振动峰几乎消失，蛋白质的酰胺I带和II带的相对强度也发生明显的变化，表明钙离子与山药榨汁液生物分子的羧基和羰基等极性基团存在着强烈的相互作用，因此含有极性基团的生物分子可以为HA的仿生矿化提供有效的成核位点，有利于形成特定的结构形貌。图2d是在纯水中制备的HA的FT-IR图谱，1080 cm-1附近的强吸收峰为PO43-的强伸缩振动峰，而560 cm-1附近的吸收谱带为此基团的弯曲振动特征吸收［19］，3500-3300 cm-1的强宽峰为氢键的特征吸收峰，强烈的结合水吸收峰导致了3572 cm-1处νOH的特征吸收峰不显著，以上图谱的分析表明此样品为HA。图2c是在山药汁液中制备的HA生物分子复合物的FTIR图谱。与图2a，b，d对比可知，该产物既含有山药汁液中生物大分子的特征峰，也含有HA的特征峰，表明产物是HA与生物大分子形成的复合物。认真分析后可以发现，这些特征峰的位置和强度与单一组分或山药榨汁液-Ca2+复合物比较，均发生了较大的变化，表明山药汁液中生物大分子不仅作为诱导HA生长的模板剂，也参与了反应，作为产物成分之一与HA紧密结合形成复合物。

3.3产物的SEM分析

图3　山药榨汁液中制备的（a，b）产物1和（c，d）产物2 的SEM图像（图3d中的插图为产物2的XRD图）

图3a和b为将山药榨汁液先与Ca2+反应，平衡后再加入H2PO4--HPO42-缓冲溶液的方法制得产物1的SEM图，可见所得产物为立方体形态，棱长约300 nm，表明这种构晶离子的加入顺序可以使HA在溶液中形成规整的形貌，而且从XRD图（图1b）可知其结晶性能良好，显然山药榨汁液中的生物大分子起到了诱导调控HA成核、取向生长的作用。由于无机的HA和山药所含生物大分子均具有良好的生物相容性［20-24］，而且在强度和韧性方面各有特色，因此形成的产物结合了两者的优势，既具有生物相容性，又有较好的物理化学性能，在骨组织修复材料领域有潜在的应用前景。

当我们在山药榨汁液中先添加H2PO4--HPO42-缓冲溶液，再加Ca2+时，发现所得产物2的形貌发生了很大的变化，见图3c和d。可以看出，产物为多孔蓬松形貌，似海绵状。这种多孔复合物具有较高的比表面积，可以作为良好的药物载体材料。从图3d的插图中还可以进一步发现，产物2的XRD图只出现一个宽化的峰，表明该复合物为无定型态。

从上述讨论可知，在相同生物分子的诱导下，由于构晶离子添加的顺序不同，可以导致产物的形态和结晶性能各异。根据经典成核理论，过饱和溶液中异相成核形成稳定的晶粒的自由能变化符合吉布斯自由能公式（1）：

其中R，Tg和S分别表示气体常数，绝对温度以及过饱和度。而溶液中的过饱和度S越大，从热力学角度看，也有利于成核。山药汁液中的蛋白质、多糖和氨基酸等生物分子所含有的极性基团，如-COOH，-NH2等很容易与Ca2+配位（参见红外谱图），形成较高的局部过度饱和微环境，并提供异相成核位点，在蛋白等生物分子的调控下，添加H2PO4--HPO42-缓冲溶液后，诱导HA的取向生长，所以易形成立方体的HA。显然，先加入Ca2+有利于形成规整形貌和结晶态的HA复合物。而首先添加H2PO4--HPO42-缓冲溶液，蛋白等生物大分子与其结合能力较弱，较难为HA的矿化提供成核位点，所以形成的HA没有规整形貌，且为无定型结构。因此我们可以通过改变反应条件控制合成我们所需要的产物。

3.4山药表面制备产物的SEM分析

图4　山药表面制备的产物3的SEM图

图4a是山药表面的SEM图像。可以看到，山药表面有微观波浪状花纹结构。图4b和c为依次添加Ca2+-H2PO4--HPO42-体系在山药表面反应后产物的SEM图，所形成的HA为扁平卵石状，粒子大小较均匀，直径约20 μm，与在山药榨汁液中生成的两种产物的形貌都有很大区别，这是因为两者诱导HA矿化的生物分子不同所导致的结果。在山药表面主要是难溶性生物分子起诱导作用，其极性基团和空间结构与榨汁液中有所不同，所以控制产物成核、生长的行为也不同。

4　结论

本文利用山药榨汁液与Ca2+-H2PO4--HPO42-体系反应，在温和条件下仿生合成了HA生物复合物。研究发现，在山药榨汁液中通过离子添加顺序的不同可以控制产物的形貌和结晶性能。先添加Ca2+，后加H2PO4--HPO42-缓冲溶液则生成了立方体状晶态HA生物复合物，而添加构晶离子顺序与此相反时，则得到无定形的多孔HA生物复合物。而在山药表面则可以调控生成卵石状HA生物复合物。该研究的结果说明山药表面基团及其汁液中的生物分子均可作为良好的模板调控HA的仿生合成。该研究为仿生合成无机/生物纳米复合材料提供了一条新途径。

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［责任编辑：钱立武］

Biomimetic Synthesis of Hydroxyapitite Biocomposites in Chinese Yam Juice

Ji Mingxiang，Xie Anjian，Shen Yuhua
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Anhui University，Hefei Anhui 230601）

The biological molecules in Chinese yam is used as reactants and templates for the biomimetic synthe⁃sis of hydroxyapitite（HA）biocomposite at room temperature and atmosphere.The results indicate that cobble⁃stone-like HA biocomposite is formed on the surface of Chinese yam while cube-shaped and porous HA biocom⁃posites are fabricated in the squeeze juice of Chinese yam with different addition orders of configurational ion，re⁃spectively，the soluble and insoluble biomolecules from the Chinese yam with diverse polar groups may play differ⁃ent roles in inducing and controlling the nucleation and growth of HA.

Biomimetic Synthesis；Biomacromolecule；Hydroxyapitite；Chinese Yam；Biocomposite

［中国分类号］O6-339A

1674-1102（2016）03-0035-04

10.13420/j.cnki.jczu.2016.03.008

2016-01-21

国家自然科学基金项目（21171001，51372004，21571002）。

嵇明翔（1990-），男，安徽蚌埠人，安徽大学化学化工学院硕士研究生，研究方向为纳米复合材料。

沈玉华（1956-），女，安徽青阳人，安徽大学化学化工学院教授，研究方向为生物矿化，高分子，无机纳米材料。