红色新月蕨与乌毛蕨多糖的抗菌活性

苏巧玲，林雄平，阮政平

(宁德师范学院生物系，福建宁德 352100)



红色新月蕨与乌毛蕨多糖的抗菌活性

苏巧玲，林雄平*，阮政平

(宁德师范学院生物系，福建宁德 352100)

[目的]从红色新月蕨和乌毛蕨中提取多糖物质，并检测多糖含量及其对5种菌类的抑菌活性。[方法]采用水提醇沉法对红色新月蕨和乌毛蕨多糖进行提取，并采用苯酚-硫酸比色法和圆形纸片法测定多糖含量以及测量不同浓度不同菌种的抑菌圈直径。[结果]红色新月蕨的多糖比乌毛蕨的多糖在含量上多0.3%，红色新月蕨和乌毛蕨的多糖对藤黄八叠球菌的抑菌圈直径分别可达33.0和21.3 mm，红色新月蕨多糖对酵母菌的抑菌圈直径为15.0 mm，乌毛蕨多糖对青霉菌的抑菌圈直径为22.0 mm，红色新月蕨和乌毛蕨多糖的最小抑菌浓度均集中在5～15 mg/mL。[结论]红色新月蕨和乌毛蕨多糖可作为功能性多糖加以开发。

红色新月蕨；乌毛蕨；多糖；抑菌活性

蕨类植物是低等的维管植物，它不仅可成为人类的食品，还具有药用价值[1]。红色新月蕨(Pronephriumlakhimpurnense(Rosenst.)Holtt.)属于金星蕨科，植株高达1.5 m以上，根状茎长而横走，通常长在海拔400～1 000 m的林下或沟溪边湿地。主要生长在我国福建、广东、广西、四川等，在印度和越南等地也有。我国的传统中医学说认为，红色新月蕨有清热解毒、祛瘀止血功效，主治疔疮疖肿、跌打损伤、外伤出血等。乌毛蕨(BlechnumorientaleL.)属于乌毛蕨科，不仅可食用，其在药用上也有很大的价值，其根状茎可药用，有清热解毒、活血散淤之效，食用乌毛蕨幼株具有清热解毒、除湿、健脾胃等功效[2]。

现代越来越多的研究表明，蕨类植物含有多种天然抗微生物和抗肿瘤活性物质[3]，而药用蕨类植物的用途正随着其他边缘学科迅速发展而日益广泛和扩大。有研究表明，乌毛蕨的水提液具有一定的抑菌活性[4]，但对于乌毛蕨的多糖物质的提取及抗菌活性尚无报道。另外，对于红色新月蕨的多糖物质提取的抗菌活性研究国内外也尚无报道。为此，该试验从来源简单、分布广泛的红色新月蕨与乌毛蕨中提取多糖，着重研究红色新月蕨与乌毛蕨中多糖提取物对5种菌类的抑菌活性，为红色新月蕨和乌毛蕨的资源开发和利用提供参考依据。

1　材料与方法

1.1材料采摘新鲜的红色新月蕨与乌毛蕨植株，采集地为宁德后山。真菌：啤酒酵母菌(SaccharomycescarlsbergensisHansen)、青霉菌(PenicilliumchrysogenumThom)。细菌：枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisCohn)、藤黄八叠球菌(SarcinaluteaSchroeter)、大肠杆菌(EscherichiacoliCastellani et Chalmers)。菌种均来自宁德师范学院微生物学实验室。

1.2方法

1.2.1材料前处理。将采摘回来的新鲜红色新月蕨与乌毛蕨植株经种类鉴定后，进行清洗并置于阴凉处风干。待其干燥后，用植物粉碎机粉碎成40目，用密封袋封好，备用。

1.2.2红色新月蕨与乌毛蕨的多糖提取。称取红色新月蕨和乌毛蕨的干粉末各100 g，并分别倒入2个烧杯中各加入1 000 mL蒸馏水浸泡完全静置24 h，将其放置于100 ℃中的水浴下加热1 h，再将温度调低至70 ℃水浴加热2 h，用纱布过滤，将清液留着，倒掉滤渣。把清液放置在70 ℃的水浴条件下，将清液浓缩成100～150 mL。把3倍体积的无水乙醇加入浓缩液中，对其离心得到沉淀，用3%三氯乙酸溶液彻底溶解沉淀后，对其再次离心取上清液。在40～50 ℃水浴的条件下将上清液蒸至恒重，并称重。

1.2.3多糖含量的测定。

1.2.3.1标准溶液的配制。准确称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖1.0 g，加水定容至100 mL，吸取2.0 mL定容至100 mL。

1.2.3.2标准曲线的绘制。分别吸取标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中，补水至2.0 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，混匀，再加入浓硫酸5 mL，振荡均匀。置于100 ℃水浴加热15 min，冷却后用分光光度计在490 nm处以试剂空白溶液为参比测吸光度。以葡萄糖质量为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线(图1)，得出回归方程为：y=0.905 7x+0.164 3(R2=0.905 5)。

图1　红色新月蕨和乌毛蕨多糖复合物的标准曲线Fig.1　Standard curve of polysaccharide compounds from P.lakhimpurense and B.orientale

1.2.3.3样品总糖含量的测定。以葡萄糖为标准品，采用苯酚—硫酸法测定总糖含量。吸取适量样液，加蒸馏水至2.0 mL，按“1.2.3.2”方法测定吸光度，根据标准曲线得到样液中多糖浓度(以葡萄糖计)。样品多糖浓度计算公式如下：

多糖含量(m)=C·V测·N

多糖提取率=(m/M)×100%

式中，C为所测多糖溶液浓度；V测为多糖溶液测定体积；N为样品稀释倍数；M为样品质量。

1.2.4抗菌效果测定。采用圆形纸片法进行测定。刮取已活化的不同菌种于不同试管中(内有5 mL无菌水中)，分别摇匀得不同菌种的菌悬液，将其倒入40～45 ℃条件的相应培养基中，快速摇匀后，快速倒于培养皿中待用。分别用移液枪将20 μL的多糖样品注入已消毒的圆形滤纸(Φ=6 mm)，等待圆形滤纸片稍微干后贴于已凝固的培养基平板上面，同时另作一组空白对照。不同的菌种分别放置于相应

的恒温培养箱中培养，待菌种成长后观察结果，并测量不同浓度不同菌种的抑菌圈宽度。以上步骤均要在无菌条件下操作完成。

1.2.5最小抑菌浓度测定。把多糖溶液稀释成2.5、5.0、7.5、15.0、30.0 mg/mL的浓度梯度，利用圆形纸片的方法，以未见抑菌圈的最高浓度为最小抑菌浓度(MIC)。

2　结果与分析

2.1红色新月蕨与乌毛蕨多糖的提取率及其含量从表1可看出，红色新月蕨和乌毛蕨多糖的得率和含量差别不是很大，红色新月蕨的多糖含量比乌毛蕨的多糖含量多0.3%，二者的多糖含量无太大的差异；乌毛蕨的多糖提取率比红色新月蕨多2.59%。

表1红色新月蕨和乌毛蕨的多糖得率与含量

Table 1The yield and content of polysaccharide fromP.lakhimpurenseandB.orientale

蕨类Fern多糖得率Polysaccharideyield∥%多糖含量Polysaccharidecontent∥%红色新月蕨P.lakhimpurense14.3012.66乌毛蕨B.orientale16.8912.36

2.2红色新月蕨和乌毛蕨多糖的抑菌圈大小由表2可见，当质量浓度为5.0 mg/mL时，红色新月蕨和乌毛蕨的多糖对5种菌类有一定的广谱抗菌活性，其抑菌圈直径为6.0～33.0 mm。从总体上看，2种蕨类的抗菌活性比较稳定，抑菌圈直径相差不大，乌毛蕨多糖对真菌中的青霉菌抑菌效果最大，为22.0 mm，而其多糖对细菌的抑菌效果有明显的差异，抑菌圈直径最小9.5 mm，最大达21.3 mm。红色新月蕨对真菌的抑菌效果相差不大，对酵母菌和青霉菌的抑菌圈直径仅相差1.8 mm，对真菌的抑菌圈直径均可达十几毫米，而对细菌的抑菌圈直径差异非常明显，最大的藤黄八叠球菌的抑菌圈直径是最小的大肠杆菌的5倍多。

表2　红色新月蕨与乌毛蕨多糖的抑菌圈直径大小

2.3红色新月蕨和乌毛蕨多糖的最小抑菌质量浓度(MIC)从表3可以看出，各种蕨类的多糖提取物对同一种菌的MIC存在一定差异，同一种蕨类植物的多糖提取物对不同菌种的MIC也有所不同；红色新月蕨和乌毛蕨多糖的MIC均集中在5～15 mg/mL。

表3　红色新月蕨和乌毛蕨多糖提取的最小抑菌质量浓度

3　讨论

把干燥后的红色新月蕨和乌毛蕨样品粉碎成粗粉末，可以增加样品的表面积，可加速样品中有效成分的浸出。陈晓

清等[5]对9种蕨类植物多糖的提取发现，华南毛蕨多糖提取率最高，达12.10%；肾蕨多糖提取率最低，仅为3.80%；多糖含量最高的是芒萁，为24.30%，最低的是华南毛蕨，仅为1.34%。而此次试验中红色新月蕨和乌毛蕨多糖的提取率均比华南毛蕨的多糖提取率高，红色新月蕨的多糖提取率比华南毛蕨的高2.20%，乌毛蕨的多糖提取率比华南毛蕨的高4.79%；红色新月蕨和乌毛蕨的多糖含量比芒萁分别少11.64%和11.94%，但红色新月蕨和乌毛蕨的多糖含量却比华南毛蕨的多，分别多11.32%和11.02%。可见，不同的蕨类其多糖的提取率和含量是有所差异的，这些差异与其生长的环境直接相关。

陶海南等[6]首次从紫萁中分离提取多糖，其得率为25.8%，对藤黄八叠球菌的抑菌圈为8.0 mm，而此次试验中红色新月蕨和乌毛蕨的多糖对藤黄八叠球菌的抑菌圈分别为33.0和21.3 mm，明显高于紫萁的抑菌效果。此次试验结果显示，红色新月蕨和乌毛蕨中提取的多糖得率为14.30%和16.89%，且从红色新月蕨和乌毛蕨中提取的多糖对枯草芽孢杆菌、青霉菌、啤酒酵母菌、藤黄八叠球菌、大肠杆菌这5种菌类均有抗菌活性，说明这2种蕨类多糖具有广谱抗菌性。我国民间中医一直有用水煎煮蕨类植物用以治疗某些病症，因此此次试验也采用100 ℃的水浴法提取多糖物质，是以研究源于生活，便于以后的大面积推广。此外，许柑叶等[7]通过蕨类抗菌筛选认为采用不同的提取剂、提取时间等提取条件，选择不同的受试菌均有可能产生相异的抗菌结果。该试验结果表明蕨类种类不同其抗菌活性差异较大，这与许柑叶等[7]的报道一致。

蕨类植物来源广泛，成本低，对于一些常见的菌类有明显的抑菌效果，具有明显的药用价值，在条件允许的情况下可大面积推广使用，但红色新月蕨和乌毛蕨二者的多糖提取物是否还有其他药用价值有待于进一步的深入研究。

[1] 许乐仁.蕨和与蕨相关的动物病[M].贵阳：贵州科技出版社，1993：8-10.

[2] 罗来辉.乌毛蕨的开发利用探索[J].内江科技，2006(8)：131-132.

[3] 蔡建秀，吴文杰，葛清秀.20种药用蕨类植物提取液抑菌试验研究[J].亚热带植物科学，2004，33(1)：22-25.

[4] 福建植物志编写组.福建植物志：第一卷[M].福州：福建科学技术出版社，1982：18-19.

[5] 陈晓清，许柑叶.九种蕨类植物多糖提取物抗动植物病原菌活性[J].亚热带植物科学，2007，36(1)：43-45.

[6] 陶海南，刘辉， 薛喜文，等.紫萁多糖抗菌活性初步研究[J].南昌大学学报(理科版)，1996，20(4)：306.

[7] 许柑叶，郑怡，陈晓清.8种蕨类植物多糖提取物抑菌效果的研究[J].福建师范大学学报(自然科学版)，2005，21(2)：99-102.

Antimicrobial Activity of the Polysaccharide fromPronephriumlakhimpurenseandBlechnumorientale

SU Qiao-ling, LIN Xiong-ping*, RUAN Zheng-ping

(Department of Biology, Ningde Normal University, Ningde, Fujian 352100)

[Objective] The aim was to extract polysaccharide fromPronephriumlakhimpurenseandBlechnumorientale, detect polysaccharide content and its antimicrobial activity. [Method] Polysaccharide fromP.lakhimpurnenseandB.orientalewere extracted through ethanol subsiding method. The polysaccharide content and antimicrobial activity was tested through the circle agar disc diffusion andMICtesting method. [Result] The polysaccharide content inP.lakhimpurnensewas 0.3% more than that inB.orientale,P.lakhimpurnenseandB.orientalepolysaccharide showed the antimicrobial acticity againstSarcinalutea, the inhibition zone was up to 33.0 mm and 21.3 mm. The inhibition zone ofP.lakhimpurnensepolysaccharides againstSaccharomycescarlsbergensiswas 15.0 mm. The inhibition zone ofB.orientalepolysaccharides againstPenicilliumchrysogenumwas 22.0 mm. The minimal inhibitory concentration of polysaccharides fromP.lakhimpurnenseandB.orientalewas in the range of 5-15 mg/mL. [Conclusion] Polysaccharide fromP.lakhimpurenseandB.orientalecould be used as functional polysaccharide.

Pronephriumlakhimpurnense;Blechnumorientale;Polysaccharides; Antibacterial activity

福建省大学生创新创业训练计划项目(201510398047)；宁德市科技计划项目(20140237)；宁德师范学院服务宁德项目(2013F18)。

苏巧玲(1995- )，女，福建漳州人，本科生，专业：生物科学。*通讯作者，副教授，硕士，硕士生导师，从事藻类学研究。

2016-04-13

S 567

A

0517-6611(2016)17-141-02