肺宁颗粒对COPD急性期大鼠的肺组织病理和血清中TNF-α、MIP-2水平的影响

祁海燕　封继宏　李美凤　 郑兆晔　刘　伟 　苏景深

关　鹏▲　李云辉　天津中医药大学(天津300073)



肺宁颗粒对COPD急性期大鼠的肺组织病理和血清中TNF-α、MIP-2水平的影响

祁海燕△封继宏▲李美凤▲郑兆晔▲刘伟▲苏景深▲

关鹏▲李云辉天津中医药大学(天津300073)

摘要目的：观察肺宁颗粒对慢性阻塞性肺疾病(COPD)急性期模型、大鼠肺组织病理及血清TNF-α、MIP-2水平的影响。方法：将60只雄性Wistar大鼠随机分为6组，分别为空白组、模型组、肺宁颗粒高、中、低剂量干预组、抗生素干预组。成功建立AECOPD大鼠模型，各干预组对应给予药物治疗，共计1周。治疗第8天观察肺组织病理，治疗第4天和第8天采用酶联免疫吸附法(ELISA )检测大鼠血清TNF-α、MIP-2含量。结果：AECOPD造模完成后，肺组织病理结果显示符合COPD病理性改变；给予药物治疗后，肺宁颗粒各剂量组及抗生素干预组肺组织病变较前减轻，结果发现，第4天和第8天，AECOPD模型组大鼠血清中TNF-α、MIP-2均较空白组升高，P<0.05；治疗后第4天结果显示除肺宁颗粒低剂量组外，余治疗组测定水平较模型组具有统计学差异(P<0.05)。治疗后第8天结果显示治疗组测定水平较模型组具有统计学差异(P<0.05)。结论：COPD急性期应用肺宁颗粒控制炎症细胞因子水平，减少COPD急性期大鼠模型炎症细胞的聚集，降低炎症反应，进一步减缓COPD进展程度，达到保护肺功能的作用。

主题词肺疾病, 慢性阻塞性/中医药疗法 @肺宁颗粒酶联免疫吸附测定动物实验

慢性阻塞性肺疾病(Chronicobstructivepulmonarydisease,COPD)是一种以持续气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病，其气流受限多呈进行性发展，与气道和肺组织对烟草烟雾等有害气体或有害颗粒的慢性炎症反应增强有关[1]。AECOPD可影响患者整体疾病的严重程度，还成为了COPD患者死亡的主要因素[2]。在AECOPD患者中应用中药，能减少急性发作次数，调节患者的整体机能，尽可能达到最大程度预防COPD急性加重的目的。

肺宁颗粒(国药准字号Z22020825)具有清热祛痰，镇咳平喘的功效，主要用于肺部感染、慢支，喘息性支气管炎，急性呼吸道感染等。药物成分返魂草主要含有氢醌、对羟基苯乙酸、熊果酸、黄酮类、倍半萜类、生物碱等成分，通过课题前期成果，设计本研究，旨在通过动物实验初步探索肺宁颗粒在COPD急性期的作用机制。

1材料与方法1.1实验动物同批次60只SPF级雄性Wistar大鼠(北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号:SCXK(京)2009-0004)，体重(180±20)g，随机分为6组，每组10只，分别设为：空白组、模型组、肺宁颗粒高、中、低剂量干预组、抗生素干预组。实验大鼠喂养于天津实验动物中心，实验室内温度控制在18～22℃，相对湿度50%～60%。常规饲料喂养，自由饮水，适应性喂养1周后开始实验。

1.2细菌肺炎链球菌标准菌株提供来源：天津市临床检验中心；标准菌株编号：ATC49619。

1.3药品肺宁颗粒(修正药业集团股份有限公司，国药准字号Z22020825)；规格：10g/袋。

盐酸莫西沙星片(德国拜耳制药公司， 国药准字号J20100158)；规格：400mg/片。

1.4主要试剂乙醚，天津市化学试剂厂，批号:Q/12HG5531-2007；弹性蛋白酶，美国Sigma公司，批号：Lot#SLBD0685v；水合氯醛，天津市密欧化学试剂有限责任公司，批号:Q/12HB4218-2009，使用时配置成10%溶液。10%中性福尔马林溶液，多聚甲醛，天津市化学试剂厂提供，批号:Q/12HG4108-2009，使用时配制成所需浓度。

1.5COPD急性期大鼠模型构建参考王东、刘又宁等人[3]构建COPD动物模型的方法，改进后建立大鼠模型，具体过程如下。

1.5.1肺气肿大鼠模型建立[4]：大鼠适应性饲养1周后开始造模。将大鼠放入直径为26～30cm密封分层干燥瓶内，并将乙醚放入干燥瓶底层，观察上层大鼠活动状态。待大鼠出现四肢紧张度降低，呼吸变慢，反应迟钝，则表示已进入麻醉期，实验过程中需随时观察动物的活动状态变化。待麻醉完成后，迅速将大鼠固定于制作好的操作台上，头高尾低位 30°仰卧，予自制圈套固定大鼠上齿，打开大鼠口腔，将自制喉镜片深入至会厌部,上抬会厌,暴露声门，待声门裂暴露于视野中，在声门开放的瞬间，将自制弯曲钝头钢针对准声门并迅速插入，钢针顶端探至声门下约 1～1.5cm处，除对照组外其余各组大鼠缓慢滴注0.15ml弹性蛋白酶溶液(7.7μ/mg，单次滴注约合6U)，对照组按照上述方法气管内滴注0.15ml生理盐水。滴注完毕后迅速退出钢针，将大鼠直立并并适度摇动15～20s，此造操作可使药物尽可能均匀分布于大鼠两肺。每7d滴入1次，共3次，造模时间21d。

1.5.2AECOPD大鼠模型建立：肺气肿大鼠模型阶段完成后，第22天起使用肺炎链球菌攻击肺气肿大鼠构建AECOPD模型，攻击1次，滴注肺炎链球菌琼脂悬液0.15ml(细菌浓度为1×1012CFU/ml)，其具体操作方法同上述肺气肿大鼠模型构建。手术后观察1h，未死亡大鼠纳入实验，并置于18～22℃恒温动物房继续饲养。

1.6给药方法给药从AECOPD造模成功后开始，参照《中药药理实验方法》中动物体表面积比率换算等效剂量，计算出大鼠各组药物的日服量。空白组：采用灭菌生理盐水2ml灌胃，1d1次，连续1周。模型组：AECOPD造模成功后，采用灭菌生理盐水2ml灌胃，1d1次，连续1周。肺宁颗粒干预组(低、中、高三个剂量组)：肺宁颗粒(修正药业集团股份有限公司，国药准字Z22020825；规格：10g/袋)，制成0.12g/(kg·d) 、0.36g/(kg·d)、1.08g/(kg·d)水溶液。AECOPD造模成功后开始灌胃，1d1次，连续1周。抗生素干预组：盐酸莫西沙星片(德国拜耳制药公司，国药准字号J20100158；规格：400mg/片)，制成40mg/(kg·d)水溶液。AECOPD造模成功后开始灌胃，1d1次，连续1周。

1.7观察指标及方法1.7.1一般情况：观察并记录造模过程中各组大鼠如行为状态、毛发光泽、进食状况等方面的变化，并定期称重并记录体重变化，造模完成后统计各组死亡率。

1.7.2肺组织病理：取材于大鼠右肺组织，10%福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋、切片、HE染色，镜下观察各组肺组织病理形态学的改变(图1)。

1.7.3采用酶联免疫吸附法(ELISA)法检测血清中TNF、MIP-2的含量， 操作步骤参照试剂盒使用说明书。

2结果2.1各组大鼠一般情况空白组大鼠活泼好动，强壮肥硕，毛发光亮，呼吸平稳，反应灵敏，饮食水正常。造模组动物活动减少，蜷缩倦怠，拱背竖毛，毛发失去光泽，呼吸频促，时有喷嚏，精神稍差。24h内接种肺炎链球菌的大鼠中，除模型组有1只死亡，其余各组未见死亡。除空白组外，各组均可见不同程度进食减少、活动能力下降，术后3天内大鼠普遍出现咳嗽症状，模型组大鼠同时伴有较明显的喘息，手术取材日之前未再出现死亡。

2.2各组大鼠肺组织光镜下病理改变见图1。

空白对照组：支气管黏膜上皮结构完整，纤毛排列基本整齐，肺泡结构完整，无明显的破坏，肺泡壁无明显增厚。未见炎细胞浸润。

模型组：支气管上皮细胞部分变形坏死、脱落，肺泡结构被破坏明显，肺泡腔明显增大，部分可见肺泡大小不一，肺泡壁明显变薄，可见不同程度的断裂继而融合成肺大泡，周围可见大量炎性细胞浸润，肺小动脉可见管壁增厚，管壁周围大量炎性细胞浸润。

肺宁颗粒低、中、高剂量组：支气管上皮细胞部分脱落，肺泡大小不等，结构紊乱，肺泡腔增大，肺大泡少见，周围可见少量炎性细胞浸润，三组上述情况较模型组均有所减轻。

抗生素干预组：支气管上皮细胞部分坏死，脱落，肺泡腔增大，肺泡壁变薄，结构紊乱，可见部分肺大泡，可见少量炎性细胞浸润。

图1　 AECOPD大鼠肺组织病理图

2.3AECOPD大鼠血清ELISA测定TNF-α、MIP-2水平见表1，表2。

表1 　肺宁颗粒对AECOPD大鼠血清TNF-α表达水平的影响(ng/L)

注： 与空白组相比较，▲P<0.05；与模型组相比较，△P<0.05

表2　肺宁颗粒对AECOPD大鼠血清MIP-2表达水平的影响(ng/L)

注：与空白组相比较，▲P<0.05；与模型组相比较△ P<0.05

结果发现，第4天和第8天，AECOPD模型组大鼠血清中TNF-α、MIP-2均较空白组升高，且具有统计学差异(P<0.05)；治疗后第4天结果显示除肺宁颗粒低剂量组外，余治疗组测定水平较模型组具有统计学差异(P<0.05)；治疗后第8天结果显示治疗组测定水平较模型组具有统计学差异(P<0.05)。

3讨论COPD的持续气流受限多呈进行性发展，AECOPD可影响患者整体疾病的严重程度[2]。炎症反应为该疾病重要特征之一，探讨其炎症介质在AECOPD发展过程中的作用及机制极为重要。参与炎症反应过程的肺泡巨噬细胞是人体抵抗病原微生物的一道重要防线[5]。肺泡巨噬细胞在COPD模型大鼠的气道炎症中作用极其重要，主要表现在：参与炎症激活的肺泡巨噬细胞释放多种介质，进一步引起巨噬细胞及其他炎症细胞的募集并促进免疫细胞成熟。

肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种来源于活化的巨噬细胞、肥大细胞及活化的T淋巴细胞等炎症细胞的细胞因子。它能激活巨噬细胞，释放更多的其他细胞因子。巨噬细胞炎症蛋白2(MIP-2)是肺泡巨噬细胞和气道上皮细胞分泌的蛋白质产物，是中性粒细胞重要的趋化细胞因子。本实验结果显示，在AECOPD模型大鼠血清中TNF-α、MIP-2 水平显著高于对照组，各应用药物组的TNF-α、MIP-2 水平低于模型组。我们推测，通过COPD急性期大鼠模型气道内肺泡巨噬细胞中促炎细胞因子TNF-α、MIP-2等分泌增加，进一步导致了气道炎症的加剧[6]，反作用于气道则更易加重COPD病情，在COPD急性期应用肺宁颗粒控制炎症细胞因子水平，减少COPD急性期大鼠模型炎症细胞的聚集，降低炎症反应，进一步减缓COPD进展程度。

综上所述，本课题组通过改良后的动物实验造模方法，能基本复制COPD大鼠模型，通过肺组织病理和血清TNF-α、MIP-2水平的测定，表明肺宁颗粒应用于COPD急性期大鼠对降低机体炎症反应有效。

参考文献

[1]中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013年修订版)[J].中华结核和呼吸杂志, 2013, 36(4):255-264.

[2] 慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD) 诊治专家组. 慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)诊治中国专家共识(草案) [J].中华哮喘杂志(电子版),2013，7(1):1-12.

[3]王东.流感嗜血杆菌形成生物被膜与慢性阻塞性肺疾患急性发作相关性的研究[D].中国人民解放军军医进修学院,2009.

[4] 封继宏,祁海燕,郑兆晔,等. 经硬式鼻腔镜气管内滴注化学制剂建立AECOPD动物模型[J]. 辽宁中医药大学学报, 2015, 17(11): 68-70.

[5]WasylnkaJA，MooreMM．UptakeofAspergillusfumigatusConidiabyphagocyticandnonphagocyticcellsinvitro:quantitationusingstrainsexpressinggreenfluorescentprotein[J]．InfectImmun，2010，78: 1214-1220．

[6]曾华东,徐虹,李理,等.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型肺泡巨噬细胞炎症及调控机制探讨[J]. 中国呼吸与危重监护杂志,2012,11(2):133-137.

(收稿2016-01-29；修回2016-02-27)

【中图分类号】R563.9

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.08.073

△陕西省中医医院(西安710003)

▲天津中医药大学第二附属医院(天津300150)