加味苓桂术甘方对酒精性脂肪肝防治作用的实验研究*

晁　旭　李　莉　王越月　王国全　杜　静 　郑旭锐

赵家荣　安庆灵　陕西中医药大学(咸阳 712046)



加味苓桂术甘方对酒精性脂肪肝防治作用的实验研究*

晁旭△李莉▲王越月△王国全杜静△郑旭锐

赵家荣安庆灵陕西中医药大学(咸阳 712046)

摘要目的：研究加味苓桂术甘方对酒精性脂肪肝防治作用。方法：SD雄性大鼠60只，随机分为6组，每组10只。50只给予15%乙醇灌胃，同时饲喂高脂饲料，制备酒精性脂肪肝大鼠模型。模型组动物给予生理盐水灌胃，实验组动物给予不同剂量的加味苓桂术甘汤和乙醇灌胃。通过观察和分析大鼠一般情况、肝脏指数、肝脏组织病理形态、血清肝功能和血脂含量等指标，研究加味苓桂术甘方对酒精性脂肪肝防治效果。结果：与模型组比较，加味苓桂术甘方干预酒精性脂肪肝动物模型后，行为有明显改善。病理分析显示，加味苓桂术甘方中剂量和大剂量组肝脏脂肪变性和炎症明显减轻。血清肝功能检测结果显示，加味苓桂术甘方中剂量和大剂量组动物用药后血清ALT、AST、 TG、TC 和 FFA 水平均明显下降。结论：加味苓桂术甘方对酒精性脂肪肝具有显著的防治作用。

主题词脂肪肝，酒精性/中西医结合疗法苓桂术甘汤/治疗应用动物实验大鼠

酒精性脂肪肝(Alcoholicfattyliverdisease,AFL) 是指由于长期酒精摄入过量而导致的肝脏疾病[1]。随着人们生活水平的提高，我国酒精性脂肪肝患者急剧增长[2]。研究显示，我国饮酒人群中80%以上的重度饮酒者患有一定程度的酒精性脂肪肝，其中10%～35%可发展为酒精性肝炎，10%～20%可发展为酒精性肝硬化。AFL在早期是可以逆转的。经戒酒和治疗后，肝损害可逐渐得以改善[3]。如果不及时治疗，演变为肝纤维化则不可逆转[4]。因此，在积极戒酒之外寻找疗效可靠的药物就显得尤为重要。

脂肪肝在中医上归属于“胁痛”、“肥气”、“肝着”、“痰浊”、“积聚”的范畴。嗜酒食肥甘厚味，伤及脾胃；加之久卧久坐，体丰痰盛，或情志失常，长期忧思郁怒，感受湿热疫毒等，均可导致肝失疏泄，脾失健运，水湿停聚，痰浊郁结，气滞血瘀，最终形成湿痰瘀阻互结，痹阻肝脏脉络而成。

加味苓桂术甘方是用于临床的治疗酒精性脂肪肝的方剂，效果良好[5]，但对其机理尚未进行深入研究。本研究采用酒精性脂肪肝大鼠模型为研究对象，通过观察给药前后动物肝脏组织病理形态，检测大鼠给药前后肝重比、肝功能、血脂含量，探讨加味苓桂术甘颗粒对酒精性脂肪肝的治疗作用。

1材料 1.1药品与试剂加味苓桂术甘方由石山楂、决明子、泽泻、茯苓、苍术、荷叶、桂枝、甘草、丹参、桃仁、姜黄、川芎和葛花13种中药材组成。本研究中所有药材均购自陕西中医学院第二附属医院中药房，并经陕西中医药大学中药教研室鉴定。药物称好后，水煎制成混悬液，-4℃冰箱保存备用。Spague-Dawlay(SD)大鼠购自西安交通大学医学院实验动物中心。

1.2酒精性脂肪肝大鼠模型的制备SD雄性大鼠60只，随机分为6组，分别为正常对照组，模型组加味苓桂术甘方大剂量组、加味苓桂术甘方中剂量组、加味苓桂术甘方小剂量组和阳性对照组，每组10只。动物适应性喂养1周后，10只正常对照组动物饲喂常规饲料。实验开始第1～3d，另外50只大鼠每天按15ml/Kg体重的剂量给予含乙醇15%(体积分数)的白酒灌胃；从第4天起每天按15ml/Kg体重的剂量给予含乙醇52%(体积分数)的白酒灌胃。同时，50只大鼠饲喂富含脂肪的饲料(普通饲料与猪油比例为85∶15，每公斤饲料给予硫酸亚铁15g)，自由饮水，连续6周。

2实验分组与给药正常对照组动物，1d1次蒸馏水水灌胃，每次4ml，自由进食。模型对照组，给予酒精性脂肪肝模型大鼠1d1次生理盐水灌胃，每次4ml，自由进食。加味苓桂术甘颗粒小剂量组，给予酒精性脂肪肝模型大鼠灌胃加味苓桂术甘汤剂，每次4ml(浓度为0.5g/ml)，1d1次，自由进食。加味苓桂术甘颗粒中剂量组，给予酒精性脂肪肝模型大鼠灌胃加味苓桂术甘汤剂灌胃，每次4ml(1g/ml)，1d1次，自由进食。加味苓桂术甘颗粒大剂量组，给予酒精性脂肪肝模型大鼠灌胃加味苓桂术甘汤剂灌胃，每次4ml(2g/ml)，1d1次，自由进食。阳性对照组，给予酒精性脂肪肝模型大鼠每天按20ml/Kg体重的剂量灌服美他多辛溶液，1d1次，自由进食。另外，除正常对照组外，其余各组动物在给予加味苓桂术甘汤剂灌胃的同时，隔天按15ml/Kg给予含乙醇体积分数为52%(体积分数)白酒灌胃1次；同时饲喂富含脂肪的饲料。白酒与味苓桂术甘汤剂分别在上午和下午灌服，连续6周。

3实验结果3.1大鼠行为学等大体情况观察 每日观察并记录动物皮毛颜色、反应能力和活动情况等，每隔3天称量动物1次，并记录数据。

3.2大鼠肝脏指数计算连续给药6周完后，所有动物处死后，摘取全部肝脏，分别称量动物体重和肝脏重量，然后计算肝脏指数。

3.3肝脏组织病理形态学分析肝组织用生理盐水冲洗后，用滤纸吸干水分，放入10 %的甲醛溶液固定。然后，每个肝脏大约取0.2cm3组织，石蜡包埋后，进行连续切片，每张切片的厚度约为2μm；烤片后，经过脱蜡、梯度酒精脱水、苏木素和伊红染液染色、酒精梯度脱水和封片等过程后，制备HE组织切片。在光学显微镜下放大400倍观察组织切片，分析肝组织的坏死状况。

3.4大鼠给药前后血清肝功能检测取大鼠静脉血2ml，3000r/min，离心0.5h后，取血清; 然后用生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的含量。

3.5大鼠给药前后血脂含量检测2ml大鼠血液放入试管倾斜静置2h后, 2000r/min离心10min，取上清液得血清。然后，按照血脂检测试剂盒的说明书检测甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、脂肪酸(FFA)的含量。

3.6统计学方法采用SPSS17.0 软件进行数据处理，组间比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

4结果4.1 各组大鼠总体情况正常组大鼠活动敏捷，毛发有光泽，紧贴皮肤，鼻、唇清洁湿润，大小便正常，体重自然增加，未发现死亡动物。模型组动物反应迟钝，嗜睡，饮食逐渐减少，第5周以后出现毛发干枯、蓬松且易脱落，鼻、唇有分泌物。与模型组相比较，加味苓桂术甘方小剂量组动物行为无明显区别；中剂量和大剂量组动物前4周反应和模型组动物类似，后期显著改善。

4.2大鼠给药前后肝重比与正常组比较，模型组大鼠的肝脏指数显著增加；与模型组比较，加味苓桂术甘方各剂量组动物用药后大鼠肝脏指数均有所改善，其中中剂量和大剂量组大鼠肝脏指数显著降低(P<0.05)(表1)。

表1　加味苓桂术甘方对AFL大鼠肝脏指数的影响(n=10)

注：相对于对照组，△P<0.01；相对于模型组，▲P<0.05

4.3肝脏组织病理形态学分析HE染色显示，正常组肝脏内无明显脂肪变性，肝小叶结构正常，肝细胞索围绕中央静脉呈放射排列(图 1,A)。AFL模型组动物肝脏弥漫大量脂肪变性，细胞体积增大，呈现大量空泡，炎症明显(图 1,B)。加味苓桂术甘方小剂量动物肝脏也有一些空泡，汇管区域伴有少量炎细胞浸润(图 1，C)。加味苓桂术甘方中剂量和大剂量组肝脏空泡显著减少，脂肪变性和炎症明显减轻(图 1，D、E)。

4.4给药前后血清肝功能变化与正常组比较，AFL模型组大鼠血清中ALT、AST的水平明显升高。与AFL模型组比较，加味苓桂术甘方中剂量和大剂量组动物药物干预后血清中ALT、AST水平显著降低(P<0.01)(表 2)。

4.5给药前后血脂含量变化结果显示，与正常组比较，AFL模型组大鼠血清中TG、TC和FFA水平均明显升高；与AFL模型组比较，加味苓桂术甘方中剂量和大剂量组动物药物干预后血清中TG、TC和FFA水平显著降低(P<0.05)(表2)。

表2　加味苓桂术甘方对AFL大鼠血清肝功能的影响(n=10)

注：相对于对照组，△P<0.01；相对于模型组，▲P<0.05 ，◇P<0.01

组 别剂量(mg/Kg)TG(mmol/L)TC(mmol/L)FFA(mmol/L)正常对照组/1.86±0.23▲2.14±2.47▲0.48±0.12◇模型对照组/2.54±0.22△3.22±0.56△1.38±0.47△加味苓桂术甘方小剂量组102.28±1.233.24±0.891.23±0.47加味苓桂术甘方中剂量组202.12±0.46▲2.32±0.57▲0.63±0.23▲加味苓桂术甘方大剂量组401.94±0.76▲2.21±0.76▲0.52±0.25◇美他多辛组201.88±0.49▲2.18±0.48▲0.51±0.24◇

注：相对于对照组，△P<0.01；相对于模型组，▲P<0.05 ，◇P<0.01

5讨论随着我国人们生活水平的提高和饮食结构的改变，酒精性肝病的发病率逐年增高。研究表明，女性每日酒精饮用量超过10～20g，男性超过20～40g即可形成酒精性肝病[5]。酒精性脂肪肝可进一步发展为肝纤维化和肝硬化，对于身体有严重危害。如果对于酒精性脂肪肝进行早期干预，可降低肝纤维化和肝硬化发生的几率。

加味苓桂术甘方由石山楂、决明子、泽泻、茯苓、苍术、荷叶、桂枝、甘草、丹参、桃仁、姜黄、川芎和葛花13种中药材组成。方中茯苓、泽泻、苍术健脾渗湿为君药；桂枝通阳化气，桃仁、红花和姜黄活血行气化瘀，川芎、赤芍养血柔肝，缓急止痛，使肝气条达，血脉通畅，为臣药；山楂消食化积、散瘀行滞，决明子清肝明目，润肠通便，为佐药；葛花解酒醒脾。甘草调和诸药为使药。全方共奏化痰解毒，逐瘀化积之功。

研究结果显示，加味苓桂术甘方干预酒精性脂肪肝动物模型后，中剂量和大剂量组动物前4周反应和模型组动物类似，后期行为有明显改善。病理分析显示，加味苓桂术甘方中剂量和大剂量组肝脏脂肪变性和炎症明显减轻。血清肝功能检测结果显示，与AFL模型组比较，加味苓桂术甘方中剂量和大剂量可显著降低大鼠血清中ALT、AST水平，具有统计学意义。另外，本研究结果也显示，加味苓桂术甘方各剂量组大鼠血清TG、TC和FFA水平均有明显下降。综上所述，加味苓桂术甘方对酒精性脂肪肝具有显著的防治作用，但其具体的机制还需进一步研究。

参考文献

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[3]中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.酒精性肝病诊疗指南[J].肝脏，2006,1：66-68．

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(收稿2016-04-02；修回2016-04-24)

【中图分类号】R575.5

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.08.071

LingguiZhugandecoctiononpreventionandtreatmentofalcoholicfattyliver
ShaanxiUniversityofChineseMedicine(Xianyang712046)
ChaoXu

ABSTRACTObjective: To examine the effect of LingguiZhugan decoction on prevention and treatment of alcoholic fatty liver. Methods:60 male Spague-Dawlayrats were randomly divided into 6 groups with 10 rats in each group. 50 rats were fed with high fat diet and ethanol fed to establish the experimental model of alcoholic fatty liver. The animal model group were administered saline, and the animals of experimental group were treated with different doses of Linggui Zhugan and ethanol gavage. General conditition, liver index, liver pathology, hepatic function and blood lipid contents of rats were to observed and analysied to investigate the effect of LingguiZhugan decoction on prevention and treatment of alcoholic fatty liver. Results:Compared with the model group, behaviors of animals of nonalcoholic fatty liver disease model group treated with LingguiZhugan decoction have significantly improved. Pathological analysis showed that the liver steatosis and inflammation of animalstreated with LingguiZhugan decoction at large dosage and medium dosage significantly reduced. Serum liver function test results show that ALT, AST of serum in groups of animals treated with LingguiZhugan decoction at large dosage and medium dosage were significantly decreased .Also TG, TC and FFA levels were significantly decreased in groups of animals treated with LingguiZhugan decoction at large dosage and medium dosage. Conclusion: LingguiZhugan decoction has significant preventive effect on alcoholic fatty liver.

KEY WORDSFatty liver, alcoholic / integrated Chinese traditional and western medicine therapyLing Gui Zhu Gan Tang/therapeutic usesAnimal experimentation Rats

*陕西省咸阳市科技计划项目(2014K04-02)

△陕西中医药大学第二附属医院(咸阳 712000)

▲上海市宝山区中西医结合医院(上海201966)