微小RNA在人类压疮组织中的异常表达

王　艳,严　志,陈慧敏,熊毅敏,徐维田

(广州军区武汉总医院,1.消化内科; 2.心血管内科,湖北 武汉,430070)



微小RNA在人类压疮组织中的异常表达

王艳1,严志2,陈慧敏1,熊毅敏1,徐维田1

(广州军区武汉总医院,1.消化内科; 2.心血管内科,湖北 武汉,430070)

摘要:目的建立人类压疮组织微小RNA表达谱。方法收集本院24例压疮组织临床样本，选取其中4例用于压疮微小RNA芯片制备。采用生物信息学算法比较压疮组织与正常组织中差异表达的微小RNA,获得压疮微小RNA表达谱。进一步利用20例测试样本，采用实时荧光定量-逆转录-聚合酶链反应对所鉴定的表达谱进行验证。结果获得了12个差异表达的微小RNA,其中包括5个表达水平上调和7个表达水平下调的微小RNA,其中表达水平下调的miR-17差异表达水平最显著。结论作者建立了一组由12个微小RNA组成的压疮组织微小RNA表达谱，为压疮发生及发展分子调控机制研究提供了丰富的素材。

关键词:压疮; 微小RNA; 基因表达谱; miR-17

压疮是长期卧床患者常见的并发症之一,发生压疮的老年患者病死率较未发生压疮老年人增加4～6倍[1]。导致压疮发生及影响其愈合的关键因素主要包括营养不良、局部组织血运欠佳、炎症反应等[2]。压疮发生、发展的分子生物学机制尚不完全明确。利用高通量的生物学技术，结合优化的生物信息学研究方法，系统地鉴定压疮组织相关分子标志物，是明确压疮发生、发展分子生物学机制、鉴定压疮早期诊断和预后判断及寻找合适的临床营养素的新途径。

1材料与方法

1.1样本收集及总RNA提取

在前期的工作中，作者从广州军区武汉总医院收集了24例临床压疮组织和20例正常皮肤、肌肉组织样本用于本研究。样本总RNA提取采用标准Trizol一步法:将组织标本利用液氮冷冻法破碎研磨，取压疮组织20 mg，加入1.5 mL进口EP管中，加入Trizol(TrizolTMReagent，Invitrogen公司)1 mL混匀。室温下放置5 min。加入200 μL氯仿，混匀后室温放置10～15 min。12 000 g,4 ℃，离心15 min,液体分为三相。取上层无色上清转入1.5 mL进口EP管中。加入500 μL异丙醇，充分混匀后室温放置10 min,沉淀RNA。12 000 g,4 ℃,离心10 min。弃上清，加预冷的1 mL 75%DEPC-H2O乙醇，洗涤RNA。7 500 g,4 ℃,离心5 min。弃上清，自然干燥沉淀。用50～80 μL DEPC-H2O溶解RNA。其中4对RNA样本(4例压疮组织及4例正常组织样本)用于微小RNA芯片制备，其余20对RNA样本(20例压疮组织及20例正常组织样本)作为测试样本，采用实时荧光定量-逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)验证芯片结果。

1.2微小RNA芯片制备

微小RNA芯片购自Super Biotek Corporation公司 (http://www.superbiotek.com/，产品名称Human oneArray v6 Microarrays)。芯片杂交结束后采用GeneChip Scanner 3000 7G(Affymetrix公司)进行描仪。采用GenePix Pro 410图像分析软件(Axon Instruments公司)分析芯片图像，将图像信号转化为数字信号，采用Lowess方法进行归一化后获得原始芯片数据。芯片杂交、数据扫描、数据归一化均由上海卓立生物技术有限公司完成。

1.3微阵列显著性分析方法和聚类分析

微阵列显著性分析方法(SAM)是一种修正的t检验算法，属于非监督聚类分析方法，由斯坦福大学开发，软件版本为SAM 3.11。作者采用变化倍数>1.5,q<0.05作为差异微小RNA筛选标准。所筛选出的差异微小RNA采用层次聚类分析方法进行图像化，获得压疮组织差异微小RNA表达谱。

1.4特异性微小RNA RT-PCR

利用前期获得的压疮样本总RNA，作者采用一种带有固定茎环结构的逆转录引物进行特异性微小RNA逆转录[3]。逆转录程序为:16 ℃ 30 min,37℃ 30 min,70 ℃ 10 min。以所获得的cDNA为模版，利用Oligo 6软件设计上游和下游PCR引物。RT-PCR实验采用RT-CyclerTM 436 系统，反应体系为20 μL,包括2 μL cDNA,0.6 μL 20× Eva Green,0.5 μL 10 μmol/L上下游引物,0.5 μL 2.5 mmol/L dNTP,1.5 U Cap Taq polymerase,10 μL 2× PCR Buffer 和6.1 μL高压去离子水。反应程序如下:95 ℃,预变性5 min; 95 ℃,30 s; 56 ℃,30 s; 72 ℃,30 s; 共40个反应循环。每个样本采用3个平行管进行校正，取平均起峰阈值(Ct值)。本研究重点检测了miR-17在压疮及正常组织中的差异表达水平，并以U6 snRNA的表达水平作为参照，采用2-ΔΔCT公式计算目的基因的相对表达水平[4],引物序列见表1。

表1　逆转录PCR实验相关引物序列

1.5靶基因预测及信号通路分析

作者利用一种权威的微小RNA靶基因预测数据库TargetScan miRNA(http://www.targetscan.org/)用于预测可能受miR-17所调控的靶基因。作者利用一个整合的基因功能注释及信号通路分析数据库MAS3.0 (http://www.capitalbio.com)进行靶基因信号通路分析。

2结果

2.1压疮组织微小RNA表达谱的建立

基于微小RNA芯片数据，作者采用SAM分析方法比较了4例压疮组织与4例正常组织的差异表达微小RNA,以变化倍数>1.5,q<0.05为筛选标准，获得了由12个差异表达的微小RNA组成的压疮组织微小RNA表达谱，包括5个在压疮组织中上调和7个下调的微小RNA。见表2。聚类分析结果见图1(压疮差异微小RNA表达谱包括12个差异表达的微小RNA，其中5个在压疮组织中上调，7个在压疮组织中下调。行:微小RNA; 列:样本；PU:压疮样本；NOR:正常样本。黄色:表达水平上调；蓝色:表达水平下调；黑色:无差异表达)。

表2　人类压疮组织微小RNA表达谱

图1 压疮与正常组织差异表达微小RNA聚类分析

2.2RT-PCR实验验证

基于前期所鉴定的压疮微小RNA表达谱，作者筛选出了其中一个表达水平下调最显著的miR-17(成熟体序列:caaagugcuuacagugcagguag)作为下一步研究对象。通过设计特异性微小RNA逆转录引物，采用RT-PCR方法检测了20例测试样本中miR-17在压疮组织及正常组织中的差异表达水平。实验结果显示，在20例压疮样本中,16例低表达miR-17,4例高表达miR-17,下调率为80%。见图2。

图2 RT-PCR实验验证

2.3miR-17靶基因预测及信号通路分析

作者利用靶基因预测数据库TargetScan预测了可能受miR-17调控的靶基因，获得了1 220个潜在的靶基因位点，其中包括458互补序列大于8-mer的强结合位点(基因)。作者利用基因功能注释及信号通路分析数据库MAS 3.0进行靶基因信号通路分析。结果显示，可能受miR-17调控靶基因参与多种信号通路，其中靶基因IL-8参与损伤修复控制、细胞凋亡、细胞因子及炎症应答等信号通路。见表3。这一分析结果有助于研究者更好地筛选压疮生物学特性相关分子标志物，进一步从分子生物学角度研究压疮的生物学进展。

表3　miR-17调控靶基因参与的信号通路分析

3讨论

微阵列(microarray)技术是鉴定疾病相关分子标志物的重要手段之一，也是系统生物学研究的基础，目前已广泛应用于科学研究及临床[5]。研究人员利用microarray技术，建立了各种人类基因及microRNA表达谱，用于揭示人类疾病发生、发展过程中的分子调控机制，并最终用于临床分子诊断、预后判断及治疗。所建立的表达谱数据上传至公共芯片数据库，供研究人员参考及进一步分析，为人类疾病的科学研究及临床应用提供了丰富的素材。

微小RNA是真核生物中一类约22nt的非编码小分子，其主要功能是通过与mRNA 3′端非编码区特异结合，抑制mRNA的翻译或促进其降解，最终调节蛋白质的表达。微小RNA在动物和植物中稳定表达，可以作为人类疾病潜在的分子标志物[6-7]。微小RNA的表达模式呈多元性，每个miRNA可以调控多个靶基因，多个miRNA也可调控同一靶基因，异常表达的miRNA可以导致整个基因调控网络的破坏或重组，与人类疾病发生、发展密切相关。微小RNA较mRNA和蛋白质更为稳定，更容易检测。采用高通量的微阵列技术，能够全面地检测人类基因组中所有微小RNA的表达水平，有助于从系统生物学角度研究人类疾病，包括压疮发生、发展，为进一步研究压疮发生、发展过程中的分子调控机制提供新的思路[8]。

本研究中，作者采用微阵列技术检测了压疮样本和正常组织中人类微小RNA的表达水平，进一步利用成熟的生物信息学分析方法，获得了12个在压疮组织中异常表达的微小RNA。这一组异常表达的微小RNA有利于进一步研究压疮发生和发展过程中的分子生物学机制，更有可能将其作为早期诊断及预后判断分子标志物应用于临床。结果发现，在所建立的压疮相关微小RNA表达谱中,miR-17在压疮组织中呈现低表达状态，其相对表达倍数超过3倍，这一异常表达状态可能与压疮组织病理过程相关。现有研究[9]表明，研究者所关注的miR-17与多种人类疾病相关。miR-17具有活化肝星状细胞的能力,能够促进胰腺β细胞及造血细胞增殖[10-11]。miR-17家族能够调节非小细胞肺癌顺铂耐药及转移[12]，在胃癌组织中调节增殖相关原癌基因的表达[13]，是口腔和食管鳞状细胞癌预后分子标志物[14-15]，具有抑制骨肉瘤细胞生长和转移的潜能[16]，与人类多发性骨髓瘤预后密切相关[17]。

然而，目前国内外暂未有压疮组织生物学特性相关微小RNA的研究报道。本研究所建立的这一组压疮相关微小RNA表达谱为研究压疮组织生物学特性提供了的研究素材，为进一步从分子生物学角度研究压疮的发生、发展提供新的思路。

参考文献

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收稿日期:2016-03-12

基金项目:湖北省自然科学基金资助项目(2012FFB06806); 湖北省卫生厅2013-2014年度科研项目(HL2012-8)

中图分类号:R 334

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)15-024-04

DOI:10.7619/jcmp.201615007

Abdominal expression of microRNA in tissue of human pressure ulcers

WANG Yan1,YAN Zhi2,CHEN Huimin1,XIONG Yimin1,XU Weitian1

(1.Department of Gastroenterology; 2.Department of Cardiovascular Medicine, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command,Wuhan,Hubei,430070)

ABSTRACT:ObjectiveTo establish microRNA expression profile in tissue of human pressure ulcer (PU).MethodsClinical samples of 24 patients with PU were selected,and 4 samples was used for preparation of micro RNA chip for pressure ulcer.Bioinformatics algorithms significant analysis of microarray (SAM) was used to identify differential expression of microRNAs,and real-time PCR was used to validate the candidate biomarkers in 20 test samples.ResultsA total of 12 differential miRNAs were selected as candidate biomarkers by using SAM algorithm,including 5 up-regulated and 7 down-regulated miRNAs in PU.The differential expression level of down-regulated miR-17 was the most significant.ConclusionAuthors establish a set of small RNA expression profile of pressure ulcer tissue composed of 12 tiny RNA,which provides rich materials for the research of the mechanism of the occurrence and development of pressure ulcers.

KEYWORDS:pressure ulcer; microRNA; gene expression profiles; miR-17