生长抑素类似物TT-232的合成

赵红玲，李松涛，邓淑华，尹志峰，王良友

(承德医学院 河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德 067000)



生长抑素类似物TT-232的合成

赵红玲，李松涛，邓淑华，尹志峰，王良友

(承德医学院 河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德 067000)

摘要：采用多肽固相合成法，以Rink Amide树脂为载体、Fmoc保护的氨基酸为原料、DIC/HOBt为缩合体系，按照生长抑素类似物TT-232的氨基酸序列从C端向N端顺次偶联，肽树脂裂解得到还原型TT-232粗品，环化后再经制备型RP-HPLC纯化，得到纯度为98%的TT-232。

关键词：生长抑素类似物TT-232；固相合成；Rink Amide树脂

1实验

1.1试剂与仪器

Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(OtBu)-OH、Fmoc-D-Phe-OH，成都诚诺新技术有限公司；RinkAmide树脂(替代度0.50mmol·g-1)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)，吉尔生化(上海)有限公司；冰乙醚、二氯甲烷(DCM)、三氟乙酸(TFA)、1,2-乙二硫醇(EDT)、苯甲硫醚、苯甲醚均为分析纯；乙腈为色谱纯；氨基酸标准品。

图1　TT-232的结构式1　The structural formula of TT-232

Agilent 1200型反相高效液相-ESI型质谱联用仪；Newstyle NP7000型反相高效半制备液相色谱仪；LC98-I AAA型氨基酸分析系统；HDFD-3 PSA型制氮机；Christ Alpha 1-4 LD型冻干机；TDL-40B型高速大容量离心机；AR224CN型分析天平；Heal Force Easy20型纯水机。

1.2方法

1.2.1还原型TT-232的合成[4]

1.2.1.1Fmoc-Thr-Rink Amide的制备

准确称取Rink Amide树脂4.002 g(2 mmol)投入固相合成反应柱中，加入20 mL DMF溶胀30 min，抽干液体；20 mL DMF洗涤一次。分别加入20 mL脱保护试剂DBLK(20%哌啶的DMF溶液)，时间分别是10 min和5 min，茚三酮检测(Kaiser法)树脂为紫红色，证明Fmoc脱除完全，可进行偶联反应。称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 2.385 g(6 mmol)、DIC 1.114 mL(7.2 mmol)和HOBt 0.972 g(7.2 mmol)，在20 mL DMF中充分溶解后加入到树脂中，连续鼓入N2，反应2 h后进行茚三酮检测，树脂为亮黄色，证明反应充分。抽滤去除反应液。20 mL DMF洗涤，脱保护。

1.2.1.2全保护还原型TT-232肽树脂的合成

按照TT-232氨基酸序列，重复1.2.1.1氨基酸脱保护与偶联方法，顺次偶联Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-D-Phe-OH。肽树脂合成完毕后，用甲醇收缩树脂，抽干甲醇，N2吹干树脂，得到流沙状肽树脂6.550 g。

1.2.2裂解与沉淀

向1 g肽树脂中缓慢加入裂解液(三氟乙酸∶苯甲硫醚∶EDT∶苯甲醚=90∶5∶3∶2，体积比)，室温裂解2 h，滤除树脂。将滤液缓慢滴加到60 mL冰乙醚中，边加边搅拌，离心10 min；取沉淀加入冷乙醚重复洗涤4次，真空减压干燥，得到还原型TT-232 粗肽0.344 g。

1.2.3二硫键的形成

将还原型TT-232粗肽加入到344 mL超纯水中，再缓慢滴加3 mL碘的乙醇溶液(20 mg·mL-1)，溶液变为淡黄色，HPLC监控氧化进程。反应完全后缓慢滴加0.1 mL饱和维生素C水溶液除去过量的碘，反应体系由淡黄色变为无色时停止滴加，经微孔滤膜过滤，得到TT-232粗品溶液。

1.2.4TT-232的分离纯化

将TT-232粗品用制备型RP-HPLC分离纯化：使用色谱柱ODS-2 反相硅胶柱(20 mm×250 mm，10 μm)；检测波长215 nm；流动相A为0.3%醋酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱(0～30 min，流动相B：15%～40%)；流速8 mL·min-1；分段收集主峰，35 ℃减压旋蒸除去乙腈，冷冻干燥得到TT-232纯品0.183 g。

1.2.5TT-232分析与结构确证

分别对还原型TT-232粗肽、TT-232粗品和TT-232纯品进行HPLC分析，分析条件为：使用Agela C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；检测波长215 nm；流动相A为0.1%TFA水溶液，流动相B为0.1%TFA乙腈溶液，梯度洗脱(0～20 min，流动相B：5%～95%)；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃。

对TT-232纯品进行MS测试及氨基酸组成分析。

样品处理：准确称取5 mg TT-232放入10 mL安瓿瓶中，加入5 mL 6 mol·L-1盐酸溶液混匀，氮气保护下密封。110 ℃下酸解24 h，将酸解液45 ℃减压浓缩，加入5 mL 0.1 mol·L-1盐酸溶液，充分溶解。

样品衍生：取0.2 mL酸解稀释液加入0.1 mL衍生剂Y(1.2%异硫氰酸苯酯的乙腈溶液)和0.1 mL衍生剂S(13.9%三乙胺的乙腈溶液)混匀，室温静置1 h，再加入0.4 mL正己烷充分振荡，静置10 min，取下层清液用蒸馏水稀释5倍，待测。

检测条件：使用氨基酸分析专用ODS柱，柱温40 ℃；流速1 mL·min-1；波长254 nm；梯度洗脱见表1。

2结果与讨论

2.1HPLC分析(图2)

由图2可知，还原型TT-232粗肽保留时间为10.884 min(图2a)，纯度为81.2%；TT-232粗品保留时间为9.827 min(图2b)，纯度为83.9%；TT-232纯品保留时间为9.769 min(图2c)，纯度为98.0%。

表1梯度洗脱表

　Tab.1The gradient elution table

图2　还原型TT-232粗肽(a)、TT-232粗品(b)、 TT-232纯品(c)的HPLC图谱Fig.2　HPLC Spectra of reduced crude peptide TT-232(a), crude TT-232(b) and pure TT-232(c)

2.2TT-232纯品的质谱分析(图3)

由图3可知，半数离子峰[M+2H]2+=474.4；分子离子峰[M+H]+=947.4，与理论值947.14相符。

2.3TT-232纯品的氨基酸组成分析结果[5]

TT-232纯品的氨基酸组成分析图谱见图4。

图3　TT-232纯品的MS图谱Fig.3　MS Spectrum of pure TT-232

图4　标准品(a)与TT-232纯品(b)的氨基酸组成分析图谱Fig.4　Amino acid composition analysis spectra of standard(a) and pure TT-232(b)

2.4讨论

Thallion Pharmaceuticals公司研究开发的TT-232是以M2型丙酮酸激酶(PKM2)为靶点的抑制剂[6]，研究表明其对60种人类肿瘤细胞系中的58种有强烈增殖抑制活性，抑制率在50%～95%之间[7]，有望用于多种实体瘤的治疗。本研究采用多肽固相合成法获得TT-232纯品，操作简便。通过不同规模重复实验(表2)可知，实验易于放大，重复性好，收率高且稳定，可为进一步药效学实验、靶向药物的设计合成提供原料，为含二硫键的多肽类抗肿瘤药物的规模化制备提供参考。

表2重复实验

Tab.2　Repeated experiment

3结论

采用多肽固相合成法，以Rink Amide树脂为载体、Fmoc保护的氨基酸为原料、DIC/HOBt为缩合体系，按照生长抑素类似物TT-232的氨基酸序列从C端向N端顺次偶联，肽树脂裂解得到还原型TT-232粗品，环化后再经制备型RP-HPLC纯化，得到纯度为98%的TT-232。

参考文献：

[1]杨公利,王春晖,唐承薇.新型生长抑素类似物TT-232抗肿瘤的研究进展[J].华西医药,2006,21(1):215-216.

[2]KERI G,BALOGH A,HORVATH A,et al.Novel antitumor peptide hormones and their effect on signal transduction[J].J Steroid Biochem Mol Biol,1992,43(1/2/3):105-110.

[3]厉保秋,高继友,历凌子,等.多肽药物研究与开发[M].北京:人民卫生出版社,2011:198-199.

[4]赵红玲,高杨,李云红,等.内吗啡肽-2的合成[J].应用化工,2015,44(6):1154-1156.

[5]王丽莉.多肽类药物的氨基酸检测方法[J].科技创新与应用,2014(16):272.

[6]严家文,钟俊,王国成,等.靶向肿瘤糖酵解途径用于肿瘤治疗的研究进展[J].中国新药杂志,2014,23(5):550-556.

[7]SZOKOLOCZI O,SCHWAB R,PETAK I,et al.TT-232,A novel signal transduction inhibitory compound in the therapy of cancer and inflammatory diseases[J].J Recept Signal Transduct Res,2005,25(4/5/6):217-235.

基金项目：河北省海外高层次人才“百人计划”资助项目(E201200002)

收稿日期：2016-03-03

作者简介：赵红玲(1977-)，女，蒙古族，内蒙古呼伦贝尔人，助理研究员，研究方向：多肽药物合成，E-mail：zhldxy@163.com；通讯作者：王良友，副研究员，E-mail：liangywang@gmail.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.07.009

中图分类号：TQ 464.7

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)07-0040-03

Synthesis of Somatostatin Analogue TT-232

ZHAO Hong-ling,LI Song-tao,DENG Shu-hua,YIN Zhi-feng,WANG Liang-you

(TheKeyLaboratoryofChineseMedicineResearchandDevelopmentofHebeiProvince,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China)

Abstract：Using a solid-phase polypeptide synthesis method with Rink Amide resin as a solid support，Fmoc-amino acids as raw materials and DIC/HOBt as a condensation system,the crude reduced somatostatin analogue TT-232 was synthesized according to its amine acid sequence from C-terminal to N-terminal by sequential coupling and cleavage of peptide resin.After cyclization,the crude somatostatin analogue TT-232 was purified by RP-HPLC with a final purity of 98%.

Keywords：somatostatin analogue TT-232;solid-phase synthesis;Rink Amide resin

赵红玲，李松涛，邓淑华，等.生长抑素类似物TT-232的合成[J].化学与生物工程，2016，33(7)：40-42，47.