UPLC-MS/MS法测定动物源食品中金刚烷胺残留

徐艳清（深圳市农产品质量安全检验检测中心，广东 深圳 518001）

UPLC-MS/MS法测定动物源食品中金刚烷胺残留

徐艳清
（深圳市农产品质量安全检验检测中心，广东 深圳 518001）

建立动物源性食品中金刚烷胺的高效液相色谱-串联四级杆质谱（UPLC-MS/MS）残留分析方法。样品用1 %乙酸乙腈提取，加入正己烷除杂；吹干浓缩后用0.1 %甲酸水溶液+甲醇（V∶V=1∶1）溶解，以0.1 %甲酸水溶液-甲醇为流动相，经C18柱分离，采用多反应监测（MRM）正离子模式进行检测。实验结果表明，金刚烷胺提取效果好，检出限为0.05 μg/kg，在1.0 μg/kg～10.0 μg/kg添加水平的平均回收率在89.4 %～110.2 %之间，相对标准偏差为2.02 %～4.31 %。本方法适用于动物源性食品中金刚烷胺残留检测。

金刚烷胺；高效液相色谱-串联质谱；抗病毒

金刚烷胺（别名：三环癸胺）是最早用于抑制流感病毒的抗病毒药，广泛用于人类流感治疗.但是，将人用抗病毒药物用于畜禽，不仅容易导致动物源性食品中药物残留、动物中毒、动物机体产生免疫抑制和耐药性等问题，还可导致病毒发生变异，影响动物疫病控制及人用抗病毒药物的有效性。我国农业部2005年第560号公告明确规定金刚烷胺等抗病毒药物在兽医上禁止使用［1］，美国FDA于2006年也禁止将金刚烷胺等人类抗病毒药物用于畜禽类。

目前，文献资料中关于金刚烷胺在动物源性组织内残留的检测方法较少，国家和行业标准也是空白，对此类药物的监管带来了不便。而鸡肉中残留的金刚烷胺含量低，基质干扰大，急需有效的前处理方法和高灵敏度的检测技术。目前，金刚烷胺的检测方法有液相色谱法、毛细管电泳法［5］、液相色谱-质谱法［2-4］等，其中液相色谱串联质谱法以其高灵敏度和可靠的确证性能，正得到越来越广泛的应用。本文采用超高效液相色谱质谱法（UPLC-MS/ MS）测定鸡肉中金刚烷胺的残留量，并对样品前处理方法和仪器分析条件进行系统优化，为禽类养殖环节金刚烷胺药物的监控提供了技术支持

1 材料与方法

1.1仪器与试剂

AcQuity UPLC/XeVo TQMS液相色谱串联质谱联用仪（美国Waters公司），电子天平（Mettler Toledo公司型号：PL2002），高速冷冻离心机（SIGMA公司，型号3K15），纯水机（德国Millipore公司），涡旋混匀器（vortex Genie2型）。

金刚烷胺（Chroma DEX公司，0.1 g/支），金刚烷胺-D15（加拿大TRC公司，1 mg/支），甲醇、乙腈（色谱纯，Merck公司）；甲酸（色谱纯，Aladdin公司）无水硫酸钠、冰乙酸。

标准溶液：精确称取10 mg金刚烷胺标准品用甲醇定溶于10 mL棕色容量瓶中，配制成1.0 mg/mL金刚烷胺标准储备液，精确称取1 mg金刚烷胺-D15标准品用甲醇定溶于10 mL棕色容量瓶中，配制成0.10 mg/mL金刚烷胺-D15标准储备液，-18 ℃以下避光保存。

1 %乙酸乙腈溶液：取冰乙酸10 mL，用乙腈稀释至1 000 mL。

0.1 %甲酸水溶液：取1 mL甲酸，用水稀释至1 000 mL。

1.2 样品前处理

取鸡肉充分绞碎，匀质，-18 ℃以下避光保存。

称取2.00 g（精确到0.01 g），样品于50 mL离心管中，加入浓度为1 μg/mL 的金刚烷胺-D15内标工作液0.04 mL，然后加入1 %乙酸乙腈溶液10 mL，漩涡2 min，3 000 r/min离心5 min，上清液转入另一50 mL离心管中，重复提取一次，合并两次上清液，备用。备用液中加入无水硫酸钠3 g，正己烷10 mL，涡旋1 min，3 000 r/min离心5 min，弃去正己烷层，剩余溶液转移至另一50 mL离心管中，40 ℃水浴中氮气吹干，加入1 mL甲醇：0.1 %甲酸水溶液（体积比为1：1），涡旋30 s，10 000 r/min离心5 min，取上清液供上机测定，过0.22 μm滤膜，进样，UPLC-MS/MS测定。

1.3 色谱质谱条件

ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，3.0 mm×100 mm），柱温：40 ℃；流动相及洗脱条件如下A为甲醇，B 为0.1 %甲酸水溶液，流速为0.6 mL/mim，梯度洗脱：起始时间至0.5mni 30 %A+70 %B，0.5 min至3 min 90 %A+10 %B，3 min至5 mni 10 %A + 90 %B，采用多反应监测（MRM）模式，分别对金刚烷胺和金刚烷胺-D15标准液进行一级离子扫描，确定化合物的电离方式和分子离子，在获得分子离子峰（母离子）质荷比后，再进行二级质谱（子离子）扫描，优化碰撞能量，确定两个丰度比较高的子离子作为定性和定量离子。在ESI（+）检测模式下，化合物质谱采集参数见表1

1.4 方法灵敏度确定

将适量金刚烷胺加入到空白鸡肉中，制成0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、2.0 μg/kg三个浓度添加样品，经上述方法进行前处理后，用超高效液相色谱质谱法检测，观察药物特征离子质量色谱峰信噪比（S/N）和对应药物浓度，S/N＞3 者定其为方法的检测限；S/N＞10 者定其为方法的定量限。

1.5 准确度和精密度的测定

采用标准添加法，在空白鸡肉中各添加1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、10 .0 μg/kg三个不同浓度药物进行回收率试验，各浓度进行6个样品平行试验，求RSD。

图2 空白基质色谱图谱

图3 鸡肉添加2.0 μg/kg的金刚烷胺色谱图

2 结果与讨论

2.1 标准曲线与定量限

配制金刚烷胺的质量浓度为0.10 μg/L～10.0 μg/L的基质匹配的标准工作液，内标浓度均为4.0 μg/L，以目标物峰面积与内标峰面积的比值Y为纵坐标，以标准工作液的浓度X（μg/L）为横坐标，进行线性回归分析，绘制标准曲线如图1。

以加标样品中待测化合物色谱峰的信噪比等于3对应的浓度为方法检出限，确定鸡肉中的金刚烷胺的检出限为0.05 μg/kg。其中空白基质及添加药物样品色谱图谱见图2和图3。

2.2 方法回收率实验

分别取鸡肉空白样品，进行加标回收试验，加标浓度分别为1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、10.0 μg/kg。将加标样品和空白样品按前述方法进行处理，上机测试，结果见表2，表3和表4。

2.3讨论：样品前处理方法的选择

从鸡肉样品中提取利巴韦林和金刚烷胺通常使用酸化或碱化的甲醇、乙腈等［2-4］。样品提取液中常含有大量的蛋白质，1 %的乙酸溶液能够使蛋白质沉淀并抑制蛋白与这些分析物结合。选择该溶液与甲醇、乙腈组成适宜浓度的混合溶液作为提取液，比较了不同配比提取液的提取效率，发现含有金刚烷胺的样品用1 %乙酸乙腈混合溶液有较高的回收率。

文献报道金刚烷胺的除杂净化都是用不同类型的SPE小柱来实现的，包括活化-上样-淋洗-洗脱等步骤繁琐，耗时长［2-4］。我们通过实验比对，发现不使用SPE柱，直接加入10 mL的正己烷除脂除杂后，氮吹后，用甲醇：0.1 %甲酸水溶液（体积比为1：1）溶解残渣，涡旋30 s，10 000 r/min离心5 min，取上清液过膜上机检测，目标物分离效果好，基质干扰很少，空白基质图谱（图1）及2.0 μg/kg阳性加标色谱图（图2），完全能达到检测要求。因此我们采用加正己烷除脂吹干后，直接溶解残渣，离心过膜的方法，大大节省了人力，物力。

3 结论

本方法建立了鸡肉中金刚烷胺的超高压液相色谱-串联质谱的测定方法。样品经过酶解、提取、净化，有效地消除了基质干扰，方法具有较高的灵敏度，以金刚烷胺- D15为内标，提高了定量准确性。经过优化试验验证，一系列浓度的标准样品溶液 （0.1 μg/L、0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、4.0 μg/L、10.0 μg/L）的标准曲线相关系数R2=0.999 9；方法检出限确定为0.05 μg/kg，满足日常检测需要；在1.0 μg/kg～10.0 μg/kg添加水平的平均回收率在89.4 %～110.2 %之间，相对标准偏差为2.02 %～4.31 %；通过回收率和多种食品样品的实测实验证明：上述方法样品前处理方法简便、快捷、易操作，液相色谱串联质谱的条件设置合理，相关参数优化较佳，灵敏度较高，可准确进行定性、定量检测，适用于可食动物肌肉、肝脏、鸡蛋中金刚烷胺残留的检测。

［1］ 中华人民共和国农业部.农业部560号公告兽药地方标准废止目录.

［2］ 白亚敏，杨小珊，毛 庆，等.超高效液相色谱质谱法测定鸡肉中抗病毒类药物残留［J］.食品工业科技，2014，24（7）：76-78

［3］ 云环，张朝晖，罗生亮，等.固相萃取/LCMS/MS法检测动物源性食品中的金刚烷胺［J］.现代仪器，2009，15（6）：42-45.

［4］ 陈慧华，韦敏珏，周炜，等.液相色谱-串联质谱法测定动物组织中金刚烷胺和金刚乙胺的残留量［J］.质谱学报，2013，34（4）：226-232.

［5］ 韩加怡，傅红云.毛细管气相色谱法测定复方盐酸金刚乙胺胶囊中的盐酸金刚乙胺［J］. 色谱，2005，23（6）：683.

S859.79+6

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1001-0769（2016）07-0064-04