四倍体神农香菊与露地菊‘纽9717’种间杂交初步研究

高文杰，周蕴薇，何淼

（东北林业大学园林学院，黑龙江 哈尔滨 150040）



四倍体神农香菊与露地菊‘纽9717’种间杂交初步研究

高文杰，周蕴薇，何淼*

（东北林业大学园林学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

以四倍体神农香菊（Dendranthema indicum var. aromaticum）和露地菊‘纽9717’（Dendranthema× gandiflorum ‘niu9717’）为试材，对其进行花粉和柱头的微观形态观察、最适花粉萌发的培养基筛选，同时测定花粉活力和柱头可授性及不同授粉方式下的结实情况，并对杂交获得的F1代植株性状进行表型分析。结果表明：四倍体神农香菊和露地菊‘纽9717’均为单粒花粉，有3个萌发沟，柱头均在丫状期开始授粉，最适花粉萌发的培养基均为ME3+150 g/L PEG4000+150 g/L蔗糖+0.1 g/L硼酸+0.1 g/L Ca2+；四倍体神农香菊在开花第4 天花粉活力最高，为64.63%，在13：00花粉活力最高，为54.56%，在开花第9天13：00—14：00时柱头可授性最强；露地菊‘纽9717’在开花第6天时花粉活力最高，为11.63%，在13：00花粉活力最高，为9.26%，在开花4～5 d 12：00—13：00时柱头可授性最强；不同授粉方式的结果显示，四倍体神农香菊与露地菊‘纽 9717’杂交在去雄、套袋、人工异花授粉条件下结实率最高（79.28%）；杂交后获得的F1代21株植株，在植株形态、叶片和花蕾方面表现出不同的性状，其中2株呈匍匐状生长，8株表现为叶长≤叶宽，7株叶缘锯齿为圆钝，10株现蕾早，且大多数花蕾为黑褐色，仅1株的花蕾为绿色。

神农香菊；露地菊‘纽9717’；花粉活力；柱头可授性

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神农香菊（Dendranthema indicum var. aromaticum）（2n=18）系菊科菊属野菊的一个变种［1］，在 1982年由刘启宏先生在神农架发现并命名。神农香菊的花、叶及根均具有浓郁的香气［2］，是菊属植物中罕见的浓郁香味种，被用来提取精油或浸膏。若将此花香性状转到栽培菊花中，培育出浓香型菊花品种，对菊属植物的品种改良具有重要意义。为克服倍性差异大种间杂交不亲和［3-5］的问题，笔者所在课题组前期诱导了四倍体神农香菊，用于后期种间杂交研究。

在育种过程中，只有了解杂交亲本的开花习性、生殖器官发育等情况，才能使杂交试验取得成功［6-7］，其中，花粉活力高和柱头可授性强是杂交成功的关键［8］。本研究以四倍体神农香菊和露地菊‘纽 9717’（Dendranthema×gandiflorum ‘niu9717’）为试材，对其花部综合特征、花部微观结构、花粉活力、柱头可授性及不同授粉方式下的结实情况等进行研究，旨在为后期神农香菊和露地菊杂交育种研究提供参考依据。

1　材料与方法

1.1材料

人工诱导的四倍体神农香菊和东北林业大学苗圃的露地菊‘纽9717’。

1.2方法

1.2.1花部综合特征观察

在四倍体神农香菊和露地菊‘纽9717’花蕾期，各选择50个花蕾进行挂牌标记，每天09：00—10：00进行观察并记录，直至花序萎蔫为止。分别记录2种花的花序组成结构，各器官的生长变化特征及持续时间等。

1.2.2花部微观结构观察

在四倍体神农香菊和露地菊‘纽9717’的盛花期，采其花序，分别对2种花的花粉和柱头进行粘台、喷金等处理，置于日立S-520扫描电镜下观察并拍照。

1.2.3花粉萌发最适培养液的筛选

以ME3+PEG4000（150 g/L）为基础培养液，添加不同质量浓度的蔗糖、H3BO4和Ca2+（以S、H和C来表示），采用正交试验L9（34）筛选最适合的培养液，共9个处理。3次重复，结果取平均值。

表1　正交试验的因素和水平Table 1 The factors and levels orthogonal experiment design

1.2.4花粉活力的测定

采用离体萌发法测定花粉活力［9-10］。从开花第1天至管状花散粉结束，每天13：00分别测定2种花的花粉活力，连续测10 d；在开花4～6 d时，每天09：00、11：00、12：00、13：00、14：00、15：00、17：00时测定两者的花粉活力，计录花粉萌发情况。

1.2.5柱头可授性的测定

采用联苯胺-过氧化氢法测定柱头可授性［11］。自开花前1 d起，每天13：00—14：00测定四倍体神农香菊和露地菊‘纽9717’的舌状花柱头可授性，连续测15 d；在开花4～6 d时，每天09：00、11：00、12：00、13：00、14：00、15：00、17：00时测定两者的花粉活力。每次选3朵花，每朵花取5个柱头测定。

1.2.6四倍体神农香菊与露地菊‘纽9717’的杂交试验

以四倍体神农香菊（2n=36）为母本，露地菊‘纽9717’（2n=54）为父本，依据Dafni方法［12-13］进行下列处理：①去雄，套袋，不授粉；②去雄，套袋，人工授粉；③去雄，不套袋，自由授粉；④不去雄，套袋，自花授粉；⑤不去雄，不套袋，自由授粉。每处理30朵花，计算结实率。将两者杂交获得的种子播种于穴盘中，常规管理，进行性状观察。

2　结果与分析

2.1花粉及柱头的微观形态特征

四倍体神农香菊花粉为单粒花粉，形状呈长椭球形，个别花粉出现异形（图1-D），有3个萌发沟（图1-B），极面观为近圆形，赤道面观为近椭圆形（图1-C），花粉粒大小约为66.92 μm×46.93 μm，花粉外壁具有刺状纹饰，刺均匀分布且长短不一（图1-A）。四倍体神农香菊管状花由花药和柱头组成，花药先成熟并散粉（图1-I），然后柱头伸长生长，高度超过花药（图1-E），柱头先呈直立型，后呈开裂状，授粉后呈羊角状（图1-F）。柱头顶端有指状乳突（图1-G），丫状期开始授粉（图1-H），授粉后指状乳突干瘪。

图1　四倍体神农香菊的花粉及柱头的微观形态Fig.1 Microcosmic morphology of pollen and stigma of tetraploid D.aromaticum

图2　露地菊‘纽9717’花粉及柱头微观形态Fig.2 Microcosmic morphology of pollen and stigma of D. ‘niu9717’

露地菊‘纽9717’花粉也是单粒花粉，形状长椭球形，极面观显现为近圆形，赤道面观显现为近椭圆形，花粉粒大小约为58.89 μm×40.28 μm，有3个萌发沟，花粉外壁具有刺状纹饰，刺均匀分布但长短不一（图2-A、2-B、2-C）。露地菊‘纽9717’管状花的花药包被在柱头外面，先是花药开始散粉（图2-D和图2-H），然后柱头伸长生长。柱头生长分3个时期（直立期、丫状期（图2-E）、羊角状期），3个时期的柱头顶端都存在指状乳突（图2-F和图2-I），丫状期开始授粉，授粉后指状乳突干瘪（图2-G）。

2.2花粉萌发最适培养液的确定

正交试验结果（表2）表明，9号培养液即蔗糖150 g/L、硼酸0.1 g/L和Ca2+0.1 g/L时，四倍体神农香菊和露地菊‘纽9717’的花粉萌发率分别为81.73%和 4.29%，为2种花粉的最适萌发培养液。极差分析结果（表3）表明，对四倍体神农香菊花粉萌发的影响大小顺序依次为蔗糖、硼酸、Ca2+，三者对四倍体神农香菊花粉萌发率的影响均达显著水平，而3因素中仅蔗糖对露地菊‘纽9717’花粉萌发有显著影响。

表2　不同质量浓度的蔗糖、硼酸、Ca2+下四倍体供试材料的花粉萌发率Table 2 Pollen germination rate in the case of the orthogonal experiment

表3　供试材料花粉萌发率的方差分析结果Table 3 The result of variance analysis of materials’ pollen germination rate

2.3花粉活力的检测结果

四倍体神农香菊在开花第1天时不散粉，第2天时开始散粉，在1～4 d时，花粉的活力逐渐升高，并在开花第4天时达到最高，为64.63%，此后随着开花天数的递增花粉的活力也逐渐降低，到开花第10天时花药散粉，此时的花粉萌发率仅为9.01%；露地菊‘纽9717’的花粉活力也随开花天数的递增呈先上升后下降的趋势，并在开花第6天时花粉萌发率最高，为11.63%（图3）。

图3　花粉活力随时间的变化Fig.3 Pollen viability different sampling times

四倍体神农香菊在09：00—13：00，花粉萌发率不断升高，并在13：00时达到最高（54.56%），14：00后花粉萌发率开始下降，在17：00时花粉萌发率仅为14.62%；露地菊‘纽9717’在11：00—13：00和14：00—15：00时与四倍体神农香菊的花粉萌发率变化规律一致，先逐渐升高，在13：00时达到最高，为9.26%，后逐渐下降（图3），因此，13：00是花粉活力较旺盛的时间，做杂交试验时应在此时间收集花粉。

2.4柱头可授性检测结果

四倍体神农香菊在开花前1 d时，舌状花柱头不具有可授性，开花当天部分具有可授性，并在开花第9天时柱头的可授性最强，开花14 d时部分柱头开始萎蔫并失去可授性，15 d时柱头全部萎蔫失去可授性。露地菊‘纽9717’在开花前1 d舌状花柱头也没有可授性，开花当天和第2天部分柱头具有可授性，在开花第4天和第5天时柱头可授性最强，随后可授性逐渐下降，到开花第 14天时部分柱头开始萎蔫并失去可授性，随后柱头萎蔫不具可授性（表4）。

表4　供试材料在不同开花时期的柱头可授性Table 4 Sigma receptivity of ray florets different number of days of flower

四倍体神农香菊舌状花柱头在09：00—17：00都具有可授性，并在13：00、14：00时柱头分泌大量黏液，此时柱头的可授性最强；露地菊‘纽9717’在9：00时只有部分舌状花柱头具有可授性，11：00—17：00柱头一直具有可授性，并在12：00、13：00时柱头可授性最强（表5）。

表5　供试材料在不同开花时间点的柱头可授性Table 5 Sigma receptivity of ray florets different sampling times a day

2.5四倍体神农香菊与露地菊‘纽9717’的杂交试验结果

杂交试验结果：四倍体神农香菊在舌状花去雄，套袋，不授粉条件下的结实率为0，说明四倍体神农香菊不存在无融合生殖；在去雄，不套袋，自由授粉条件下的结实率为40.77%；不去雄，套袋，自花授粉时的结实率为37.84%；不去雄，不套袋，自由授粉处理时的结实率为49.62%；去雄，套袋，人工异花授粉（露地菊‘纽9717’）处理时结实率显著提高，为79.28%。由此可判定四倍体神农香菊的繁育体系为异交（部分自交不孕），需要传粉者。

2.6四倍体神农香菊与露地菊‘纽9717’杂交F1

代的表型分析

将两者杂交后获得的种子播种于穴盘中，进行常规管理，共获得21株杂交后代，其中2株呈匍匐状生长，这与母本性状相似，19株随父本呈直立生长；叶型根据长宽比分为2类，长度不大于宽度的有8株，长度大于宽度的有13株。叶缘锯齿可分圆钝和尖锐2类，其中圆钝的有7株，尖锐的有14株。10株现蕾早，且大多数花蕾为黑褐色，仅1株的花蕾为绿色。

3　结论与讨论

本研究结果表明，四倍体神农香菊和露地菊‘纽9717’花粉的最适萌发培养基均为ME3+150 g/L PEG4000+150 g/L蔗糖+0.1 g/L硼酸+0.1 g/L Ca2+；四倍体神农香菊与露地菊‘纽9717’杂交在去雄，套袋，人工异花授粉条件下的结实率最高，为79.28%；四倍体神农香菊的花粉活力在头状花序开花第4天时达到最高（64.63%），露地菊‘纽9717’在开花第6天时达到最高（11.63%），两者存在一定的差异，这可能与野生神农香菊的抗性及对环境的适应能力较强有关［14-15］，两者均在13：00时花粉活力最高，这可能是由于四倍体神农香菊和露地菊‘纽9717’在黑龙江的花期较晚（10月下旬），正午最高温度不高于20 ℃，是菊花的最适生长温度。柱头可授期是花朵成熟过程中的一个重要时期，它在很大程度上影响自花传粉率、杂交结实率等［16］。本研究经联苯胺—过氧化氢检测发现，四倍体神农香菊和露地菊‘纽9717’的舌状花柱头可授性均随开花天数的推移先增强后减弱，其中露地菊‘纽9717’在头状花序开花第4天和第5天12：00—13：00时舌状花柱头的可授性最强，四倍体神农香菊在开花第9天13：00—14：00时舌状花柱头的可授性最强，判断两者雌蕊均发育正常，可作为杂交试验的母本。

杂交育种不但要考虑杂交亲和性、父本的花粉活力，而且还要考虑母本的柱头可授性。选择父本花粉活力最高、母本柱头可授性最强时进行授粉，杂交试验的成功率才能更高。

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责任编辑：尹小红

英文编辑：梁 和

Primary research on distant hybridization between tetraploid Dendranthema indicum var. aromaticum and Dendranthema × gandiflorum ‘niu9717’

GaoWenjie， Zhou Yunwei， He Miao*
（College of Landscape and Architecture， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

In this experiment， tetraploid Dendranthemaindicum var. aromaticum and Dendranthema×gandiflorum ‘niu9717’ were used as material to study pollen and stigma morphology， pollen viability and stigma receptivity， the optimal pollen germination medium， and analyse seed setting rate in different hybrid method and morphological characteristics of F1plants. The results showed that both tetraploid Dendranthemaindicum var. aromaticum and Dendranthema×gandiflorum‘niu9717’ had single pollen grain with three germination ditch and stigma pollinating in the bifurcation stage. The best medium for pollen germination was ME3+ 150 g/L PEG 4000 + 150 g/L Sucrose + 0.1 g/L H3BO4+ 0.1 g/L Ca2+. Tetraploid Dendranthema indicum var. aromaticum had the highest pollen viability on the fourth day of blossom （64.63%） and at 13：00 pm in a day （54.56%） and the strongest stigma receptivity on the 9th day of blossom and at 13：00 to 14：00 in a day， while Dendranthema × gandiflorum ‘niu9717’ had the highest pollen viability on the 6th day of blossom （11.63%） and at 13：00 pm （9.26%） in a day and the strongest stigma receptivity on the 4th to 5th day of blossom and at 12：00 to 13：00 in one day. Comparing with different pollination ways of tetraploid Dendranthema indicum var. aro maticum and Dendranthema×gandiflorum‘niu9717’， the way of emasculation， bagging and handcross-pollination had the highest seed setting rate （ 79.28%） and obtained 21 F1hybrids with different characteristics in plant morphology， leaf and flower bud， which 2 plants with creeping growth， 8 plants with leaves of length≤width， 7 plants’with leaves of blunt sawtooth margin， 10 plants with earlier flower budding， and most of the buds were dark brown， only 1 was green.

Dendranthema indicum var. aromaticum； Dendranthema×gandiflorum ‘niu9717’； pollen viability； stigma receptivity

高文杰（1970—），女，黑龙江双鸭山人，博士研究生，主要从事园林植物资源研究，wenjie_gao724@163.com；*通信作者，何淼，博士，副教授，主要从事园林植物种质资源研究，hemiao@nefu.edu.cn

S682.1+1；S503.51

A

1007-1032（2016）04-0374-06

2015-12-28 修回日期：2016-06-10

中央高校基本科研业务费专项资金项目（2572015EY03）