油菜种子种皮的结构和细胞壁成分研究

文婷婷，利 站，林 程，黄玉韬，关亚静，胡 晋*

（1.浙江大学 农业与生物技术学院种子科学中心，浙江 杭州 310058；2.山东省种子管理总站，山东济南 250100）

油菜种子种皮的结构和细胞壁成分研究

文婷婷1，2，利 站1，林 程1，黄玉韬1，关亚静1，胡 晋1*

（1.浙江大学 农业与生物技术学院种子科学中心，浙江 杭州 310058；2.山东省种子管理总站，山东济南 250100）

为探索油菜种皮的结构和细胞壁成分，借助扫描电镜和倒置生物显微镜对种皮表面和横断面结构进行观察，并采用显微化学鉴别法和红外光谱分析法鉴定种皮细胞壁成分。结果表明，油菜种皮表面纹饰为网-穴型，网眼由不规则的管状多边形组成；种皮横断面结构由外到内依次为表皮层、栅栏层和糊粉层；靠近种脐处种皮内有白色薄膜，栅栏层和糊粉层结构均逐渐变窄直至消失，种脐处种皮由两层致密结构组成。油菜品种浙双3号的种皮细胞壁中含有纤维素、木质素、色素、角质、蛋白质、果胶和脂类等成分。

油菜；种皮结构；细胞壁成分

文献著录格式：文婷婷，利站，林程，等.油菜种子种皮的结构和细胞壁成分研究［J］.浙江农业科学，2016，57（1）：22-25.

油菜是世界四大油料作物之一，在世界油料作物中占有重要地位，也是我国重要的食用油来源和植物蛋白质饲料资源［1］。种皮是种子胚胎与外界环境间的重要生物屏障，在保护胚胎免受各种生物和非生物逆境危害方面具有重要的意义［2］。此外，种皮在调控胚胎发育、种子休眠和萌发、种子品质等方面也起着重要的作用。油菜种皮占全籽的12%～19%，种皮中含有粗蛋白质 18% ～20%，粗脂肪16%，粗纤维31%～34%，菜籽中大部分色素、芥子碱和单宁等抗营养物质也主要存在于种皮中，因此，种皮是影响油菜籽饼粕蛋白质利用价值的重要因素［3］。研究油菜种皮的结构和成分，对种子吸水萌发、贮藏以及种子处理等具有重要的作用。然而当前对油菜种皮结构和成分的研究尚未见报道，本文应用扫描电镜和冷冻切片观察种皮结构，显微化学鉴别法和红外光谱分析法鉴定种皮细胞壁成分，以期为油菜种子的萌发、休眠特性的研究，油菜种质资源贮藏以及油菜籽的综合利用等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验选用油菜种子（浙双3号）为材料，于4℃冰箱贮藏备用。

1.2 方法

1.2.1 扫描电镜观察种皮结构

扫描电镜观察种皮结构前的种子预处理参考刘强等［4］的方法，种子用0.1 m o 1·L-1pH值6.9的磷酸缓冲液（PBS）浸泡12 h，接着在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜，倒掉固定液，用0.1 m o 1·L-1P B S漂洗样品3次，每次15 min。将种皮剥离，横切种脐，用1%的锇酸溶液固定样品1～2 h，倒掉固定液，用0.1 m o 1·L-1P B S漂洗样品3次，每次 15 min。用 50%，70%，80%，90%，95%的乙醇溶液对样品依次进行脱水处理，每种浓度处理15 min，再用100%的乙醇处理两次，每次20 min，接着用乙醇与醋酸异戊酯的混合液（V∶V为1∶1）处理样品30 min后，用纯醋酸异戊酯处理样品过夜。将样品进行临界点干燥，离子溅射镀膜，扫描式电子显微镜（X L 30-E SE M，荷兰飞利浦公司）观察，拍照。

1.2.2 冷冻切片观察种皮色素分布

将油菜干燥种子的种皮剥离下来，利用冰冻切片机（Shandon FE+Shandon Finnesse32，美国 Thermo公司）在-25℃下冰冻切片，厚度7μ m。切片不经染色，直接制成水装片，于倒置生物显微镜（Leica DMIRB，德国Leica公司）下观察，并用附带的成像系统拍照。

1.2.3 显微化学鉴别法鉴定种皮细胞壁成分

显微化学鉴别法鉴定种皮细胞壁成分参考刘军等［5］的方法，取种子种皮分别在碘-氯化锌溶液、盐酸间苯三酚试剂和苏丹Ⅳ酒精饱和溶液中染色，观察种皮横断面染色结果。

1.2.4 红外光谱分析法鉴定种皮细胞壁成分

取种子种皮，液氮研磨成粉末状，用于红外光谱扫描观察。红外光谱仪（AVATAR370型，美国Thermo Nico1et公司），光谱分辨率4 cm-1，扫描信号累加32次。参照谢晶曦［6］、徐荣等［7］和张晓斌等［8］的分析方法对细胞壁成分进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 油菜种皮表面和横断面结构

在扫描电镜下观察到，油菜种皮表面纹饰为网-穴型，网眼由不规则的管状多边形组成，网眼的大小和深浅各不相同（图1中a）。种脐部表面与非种脐部表面纹饰不同，种脐部表面纹理粗糙、不规整（图1中b）。种子遇水后，表皮层细胞中的黏质分泌出来，在种皮表面形成透明的黏质层（图1中c）。

油菜种皮横断面可分为三层结构（图1中d）：最外覆盖的一薄层为表皮层。表皮层下面是栅栏层，为U形-a（U-shaped-a）状结构，结构较致密，但有缝隙，该层厚度为25.9～38.5 μ m。第三层为糊粉层，厚度为22.7～27.8 μ m。栅栏层、糊粉层厚度分别约占种皮总厚度的56%和44%。

靠近种脐处，种皮内有白色薄膜（图1中e）。栅栏层和糊粉层结构均逐渐变窄，直至消失。种脐处由两层致密结构组成，厚度分别为 37.1～47.5 μ m和 7.6～15.2 μ m，各占种皮总厚度的79%和21%，两层结构间有一条缝隙。

图1 油菜种子种皮表面及横断面扫描的电镜照片

2.2 油菜种皮色素分布

不经染色，直接在显微镜下观察冰冻切片，可以清晰地看到油菜种皮的三层横断面结构，分别为表皮层、栅栏层以及糊粉层（图2）。其中，种皮色素即为图中的棕色带，主要分布在栅栏层。

2.3 显微化学鉴别法鉴定种皮细胞壁成分

油菜种皮横断面结构经碘-氯化锌溶液染色呈棕色，盐酸和间苯三酚反应染成桃红色，苏丹Ⅳ酒精饱和溶液染色呈紫红色。由此可推测油菜种皮细胞壁中含有较多的纤维素、木质素和角质。

2.4 红外光谱分析法鉴定种皮细胞壁成分

傅立叶变换红外光谱（FTIR）图中2 925.33 和2 853.78 cm-1附近是饱和C—H键的伸缩振动吸收，主要来自细胞壁中蛋白质、纤维素和果胶等组织成分（图3）。1 746.19 cm-1为脂类中饱和羧酸酯键中羧基C=O的伸缩振动吸收峰。1 651.36 cm-1附近为细胞壁蛋白质上的C=O（酰胺Ⅰ带）。1 538.61 cm-1附近为蛋白质上N—H特征吸收峰（酰胺Ⅱ带）。1 056.10 cm-1附近主要为纤维素糖链中 C—C和 C—O键的吸收峰，1 455.33和1 384.29 cm-1附近为纤维素中甲基的伸缩振动吸收峰。由此可知，油菜种皮中主要含有纤维素、果胶、蛋白质和脂类等成分。

图2 油菜种子种皮的色素分布

图3 油菜种皮的红外光谱

3 小结与讨论

3.1 油菜种皮结构

种皮是由珠被发育而来的套被状结构，包围在胚和胚乳之外，是种子的重要组成部分之一，具有保护种胚和促进萌发时吸收水分的作用［9］。种皮是植物体保守性较强的器官，其形态性状和解剖构造在长期的自然进化过程中形成，是受基因控制的稳定性状，受环境影响较小，因此可以作为分类的重要依据［10］。

不同物种植物的种皮纹饰亚微结构特征存在种的特异性［11］，表明种皮纹饰特征是稳定可遗传的，可用作物种鉴定指标，为分析不同物种的进化及亲缘关系提供了可行的方法［12］。有学者认为种皮纹饰由栅栏层高度不平衡或栅栏层外壁突出而引起。本研究发现，油菜种皮表面纹饰呈现出中央下陷的网-穴状结构，网眼由不规则的管状多边形组成，可能有利于种子吸水。种子遇水后，表皮层细胞中的黏液分泌出来，迅速扩大、破裂，包围整个种子表皮细胞的外层细胞壁，有助于种子水化和种子传播，促进种子在缺水条件下萌发和形成幼苗。

扫描电镜和显微镜下观察到油菜种皮结构由表皮层、栅栏层和糊粉层组成，且色素主要分布在栅栏层。栅栏层由外珠被的最内层细胞发育而来［13］，其致密的结构阻碍种子对水分的吸收。陈玉萍等［14］认为种皮颜色主要由栅栏层决定，并认为栅栏层斑点上的色素可能是由糊粉层上的色素转移而来。

靠近种脐处，种皮内有白色薄膜，栅栏层和糊粉层结构均逐渐变窄，直至消失。种脐处由两层致密结构组成，厚度分别为37.1～47.5 μ m和7.6～15.2 μ m，各占种皮总厚度的79%和21%，两层结构间有一条缝隙。油菜种脐处的特殊结构可能与种子发育过程中营养物质的运输和种子萌发时的水分运输有关。

3.2 油菜种皮细胞壁成分

种皮合成一系列化合物，在种子抗病虫害、发育调控方面起重要作用，也可作为工业产品的原料，食品与饲料的营养成分。此外，种皮成分对植物的整体质量、价值和产量也产生影响。油菜种皮成分复杂，含有水、蛋白质、糖类、矿物质、纤维素、木质素、色素等［15］。

由显微化学鉴别法和红外光谱分析法鉴定表明，本研究油菜品种的种皮细胞壁中含有纤维素、木质素、色素、角质、蛋白质、果胶和脂类等。纤维素是植物细胞壁的主要成分，牢固的纤维素结构使细胞壁具有高强度和抗化学降解的能力［16］。孙群等［17］通过测定硬实种子和非硬实种子种皮粉末中粗纤维含量的差异，认为粗纤维的大量积累增加了种皮的机械强度和不透水性。相关性分析表明：种皮厚度与种皮纤维素含量呈极显著正相关，与千粒重呈极显著负相关，即种皮厚，种皮纤维素含量高，千粒重小［18］。木质素使细胞相连，可增加细胞壁的抗压强度，强化植物组织，其含量可能与皮壳率成正相关关系，影响着种皮的厚度及坚硬度［19］。此外，木质素可能也是产生油菜种皮颜色的物质之一，具有天然的多酚类结构，是由苯丙烷单元组成的聚合物，含有发色基及助色基，可与多种物质结合而生成有色物质，也可经氧化生成醌类物质而显色［20］。有研究表明，种皮木质素含量与油菜的含油量、蛋白质含量等性状也相关。种皮色素决定油菜籽颜色，同时色素物质也作为信号分子和植物抗菌素参与逆境胁迫、种子休眠等生理过程［21］。Mar1es等［22］研究认为，油菜种皮中的色素组成主要是原花色素，原花色素是一种类黄酮物质，也称为缩合单宁。角质存在于种皮表皮层，是妨碍水分渗入种内，造成种子硬实的重要原因之一［23］。油菜种子内含有比较丰富的蛋白质，具有负衬质势，对水分的吸引力很强，因此种子一遇水就会依靠其强大的吸胀作用而迅速吸水［24］。果胶是形成胶质的主要物质，其主要成分是鼠李半乳糖醛酸。果胶作为细胞间的中层起黏合作用，使相邻的细胞黏合在一起，具有水溶性。

油菜种皮结构和细胞壁成分的研究可为油菜种子萌发特性的分析和油菜种质资源贮藏提供有利依据，但是各结构及成分对种子吸水萌发和种子品质产生的不同影响还需进一步研究。

［1］曲存民，付福友，卢坤，等.不同环境中甘蓝型油菜种皮木质素含量的QTL定位［J］.作物学报，2011，37（8）：1398-1405.

［2］伍晓明，曾长立，胡琼，等.甘蓝型油菜与野芥属间体细胞融合杂种后代种皮纹饰亚微结构研究［J］.中国油料作物学报，2009，31（2）：122-126.

［3］罗晨曦，周建平，周春灵.油菜籽种皮混合发酵生产饲料蛋白的研究［J］.现代食品科技，2011，27（11）：1363-1366.

［4］刘强，王平平，苗福，等.濒危植物鄂尔多斯半日花种皮结构的研究［J］.天津师范大学学报（自然科学版），2003，23（3）：20-23.

［5］刘军，卢萍.红豆草和扁蓿豆种子种皮结构的比较研究［J］.内蒙古师范大学学报（自然科学汉文版），2005，34（3）：369-371.

［6］谢晶曦.红外光谱在有机化学和药物化学中的应用［M］.北京：科学出版社，1987.

［7］徐荣，孙素琴，陈君，等.肉苁蓉种子成分及活力的红外光谱分析［J］.光谱学与光谱分析，2009，29（1）：97-101.

［8］张晓斌，刘鹏，李丹婷，等.铬诱导植物根细胞壁化学成分变化的FTIR表征［J］.光谱学与光谱分析，2008，28（5）：1067-1070.

［9］李正理，张新英.植物解剖学［M］.北京：高等教育出版社，1983.

［10］孟秋峰，王毓洪，周焕兴，等.园艺植物保守器官分类研究进展［J］.长江蔬菜，2008（10）：1-3.

［11］BUTH G M，ARA R，NARAYAN A.Seed and seed coat anstomy of some members of tribe Arabideae（ Brassicaceae）［J］.Phytomorpho1ogy，1987，37：341-348.

［12］韦存虚，李爱民，张永泰，等.白芥和甘蓝型油菜属间杂种后代种子结构比较［J］.作物学报，2009，35（6）：1139-1145.

［13］陈宝元，孟金陵.甘蓝型油菜种皮发育的初步观察［J］.华中农学院学报，1984，3（2）：5-8.

［14］陈玉萍，刘后利.甘蓝型油菜种子发育进程中种皮颜色变化［J］.中国油料，1995，17（2）：1-3.

［15］唐志东，鲁军雄，袁玉辉.油菜种皮色素的研究进展［J］.作物研究，2013，27（2）：197-202.

［16］王忠.植物生理学［M］.北京：中国农业出版社，2006：16-18.

［17］孙群.乌拉尔甘草种子硬实程度的无损鉴定与硬实形成机理研究［D］.北京：中国农业大学，2008.

［18］TANG Z L，LI J N，ZHANG X K.Genetic variation of ye11ow-seeded rapeseed 1ines（ Brassica naPus L.） from different genetic sources［J］.P1ant Breeding，1997，115：471-474.

［19］梁艳丽，梁颖，李加纳，等.甘蓝型黄、黑籽油菜种皮特性比较研究［J］.中国油料作物学报，2002，24（4）：14-18.

［20］葛明裕.木材加工化学［M］.哈尔滨：东北林业大学出版社，1985：67-84.

［21］LOZOVAYA V V，LYGIN A V，ULANOV A V，et a1.Effect of temperature and soi1 moisture status during seed deve1opment on soybean seed isof1avone concentration and composition［J］.Crop Science，2005，45（5）：1934-1940.

［22］MARLES M A，RAY H，GMBER M Y.New perspectives on proanthocyanidin biochemistry and mo1ecu1ar regu1ation［J］.Phytochemistry，2003，64：367-383.

［23］杜宝红，石凤翎，锡林塔娜，等.扁蓿豆种子发育形态解剖学研究［J］.种子，2007，26（6）：7-11.

［24］李合生.油菜种子萌发生理的研究［J］.植物生理学通讯，1981（4）：21-25.

（责任编辑：张 韵）

S634.3

A

0528-9017（2016）01-0022-04

10.16178/j.issn.0528-9017.20160109

2015-11-01

浙江省自然科学基金重点项目（Z 3100150）；浙江省科技厅旱粮农业新品种选育专题（2012C 12902-6-5）

文婷婷（1989-），女，硕士，助理农艺师，主要从事种子科学研究工作，E-mai1：wtt 250100@163.com。

胡 晋，男，教授，博士生导师，从事种子科学研究工作，E-mai1：jhu@zju.edu.cn。