血浆m icroRNA-182在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

张艳艳，徐爱晖，李永怀，胡华青

血浆m icroRNA-182在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

张艳艳1，徐爱晖1，李永怀1，胡华青2

目的 探讨microRNA-182（miR-182）在非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆中的表达及临床意义。方法 采用实时荧光定量PCR法检测47例NSCLC患者（NSCLC组）和39例体检健康者（对照组）血浆中miR-182的水平，同时用电化学发光法检测其血清癌胚抗原（CEA）及细胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）含量。分析miR-182与NSCLC患者临床特征的关系。绘制受试者工作特征（ROC）曲线，评估miR-182的诊断价值。结果 miR-182在NSCLC组血浆的相对表达量为1.610（1.435，1.975），与对照组的1.060（0.730，1.355）比较，显著升高（P＜0.01）；miR-182表达在胸膜转移上差异有统计学意义（P＜0.05）；在肿块大小、病理类型、TNM分期及淋巴结转移上差异无统计学意义；血浆miR-182为1.365时，灵敏度为89.4%，特异度为79.5%；miR-182联合CEA 及 CYFRA21-1时，曲线下面积（AUC）为0.995，灵敏度高达93.6%，特异度为97.4%。结论 NSCLC患者血浆miR-182表达明显上调，联合CEA及CYFRA21-1可弥补单一检测的局限性。miR-182有望作为一种新的生物标志物用于NSCLC的辅助诊断。

非小细胞肺癌；血浆microRNA-182；实时荧光定量PCR

网络出版时间：2016-3-8 8：29：02 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.058.htm l

肺癌是全世界癌症相关死亡的主要原因之一，约85%是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），80%～90%患者确诊时已属晚期，5年生存率仅约15%［1］。目前广泛应用于临床的肿瘤标志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）敏感度低，细胞角蛋白19片段（cytokeratin 19-fragment，CYFRA21-1）特异性差。研究［2］表明，胸部影像学检查显示的肺部结节，约50%是良性的。另外，经皮肺穿刺术及支气管镜术均为有创检查。因此，需要建立新的非侵入的、敏感的、实用的早期筛查方法。microRNA（miR）是一类长约20～25 nt的非编码RNA，在转录后水平调节基因表达。近年来研究［3-4］显示，miR的异常表达与实体肿瘤的发生发展密切相关。miR-182是miR-183家族的一员，血浆中也存在miR-182，其能耐受内源性核糖核酸酶而保持稳定性。研究［5］显示miR-182在NSCLC组织中表达增高，但在NSCLC血浆中的表达报道少见。该研究用实时荧光定量PCR法检测miR-182 在NSCLC患者血浆中的表达情况，研究其与各临床特征之间的关系，探讨血浆miR-182水平对NSCLC的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 病例资料 收集2014年10月～2015年7月于安徽医科大学呼吸内科及胸外科住院的初诊NSCLC患者47例（NSCLC组），其中男27例，女20例；年龄41～80（63.01±8.09）岁，均经病理学或细胞学检查确诊。其中腺癌25例，鳞癌20例，腺鳞癌2例；根据国际抗癌联盟（UICC，2009年第 7版）TNM分期Ⅰ期4例，Ⅱ期6例，Ⅲ期12例，Ⅳ期25例。其中胸膜侵及者17例，未侵及胸膜者30例。收集2015年4月～2015年5月本院体检中心的健康者39例（对照组），男21例，女18例；年龄40～76（58.25±7.45）岁。分别抽取全血4 ml，EDTA-K2抗凝，2 h内常温，2 624 r/min离心10 min，取上层血浆，4℃、11 836 r/min离心15 min后，置于-80℃冰箱保存。

1.2 主要试剂 miRVana PARISKit（美国Ambion公司）；EzOmicsTM一步法实时荧光定量PCR检测试剂盒、miR-182特异性茎环逆转录引物、上下游引物（百奥迈科生物科技有限公司）。

1.3 血浆m iRNA的提取 取冰冻血浆500μl，按照miRVana PARISKit说明书提取总RNA。RNA溶解于20μl无RNA酶水中。

1.4 实时荧光定量PCR 按照EzOmicsTM一步法实时荧光定量 PCR检测试剂盒说明书操作。总反应体系为20μl，包括RNA模板50 ng，2×Mastermix 12.5μl，miR-182特异性茎环逆转录引物（20 μmol/L）0.5μl，上下游引物（20μmol/L）各0.5μl，DEPC-H2O补充至20μl。循环参数：42℃反转录60 min；95℃热失活变性10 min；95℃、20 s，62℃、30 s，72℃、30 s，共40个循环。结果用2-ΔΔCt法［6］计算。ΔCt=目标基因Ct-内参基因Ct，ΔΔCt=待测标本ΔCt-对照样本ΔCt。

1.5 血清CEA及CYFRA21-1 安徽医科大学第一附属医院核医学科采用电化学发光法检测血清CEA、CYFRA21-1，使用仪器为罗氏公司E601电化学发光仪，试剂由欧诺公司提供，正常参考值为CEA 0～5.0 ng/m l，CYFRA21-1 0～3.3 ng/ml。

1.6 统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行分析。正态分布资料用±s表示，比较采用t检验；偏态分布用中位数和四分位数间距［M（Q1，Q3）］表示，采用Mann-Whitney U检验；等级资料采用Spearman相关系数检验；绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，评估血浆miR-182的诊断效能；Logistic回归分析miR-182联合CEA及CYFRA21-1的诊断价值，绘制联合ROC曲线。

2 结果

2.1 荧光定量PCR法检测U6 snRNA和m iR-182表达 NSCLC组血浆U6 snRNA的Ct值为（14.76 ±0.33），对照组血浆中 U6 snRNA的Ct值为（14.86±0.58），差异无统计学意义（t=0.97），U6 snRNA在两组中稳定表达。miR-182在NSCLC患者血浆的相对表达量为［1.610（1.435，1.975）］，与对照组［1.060（0.730，1.355）］比较，差异有统计学意义（U=179，P＜0.01）。见图1。

图1 NSCLC组与对照组血浆m iR-182相对表达量与对照组比较：**P＜0.01

2.2 血浆m iR-182与NSCLC患者临床病理特征之间的关系 Ⅰ/Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期 NSCLC患者血浆miR-182水平均显著高于对照组（U=44、28、107，P＜0.01）；Spearman相关分析显示血浆miR-182水平与TNM分期差异无统计学意义（rs= 0.055，P=0.713）。箱内线代表中位数，两端线分别代表下四分位数和上四分位数，上下限分别表示最大值和最小值，见图2。在侵及胸膜组相对表达量较未侵及胸膜组减低，差异有统计学意义（U= 156.5，P＜0.05）。见图3。与其他临床病理参数无关。见表1。

表1 血浆　m iR-182表达水平与47例NSCLC患者临床病理特征的关系［M（Q1，Q3）］

图2 对照组与TNM分期各组血浆　m iR-182相对表达量与对照组比较：**P＜0.01

图3 未侵及胸膜组与侵及胸膜组血浆m iR-182相对表达量与未侵及胸膜组比较：*P＜0.05

2.3 血浆m iR-182在NSCLC中的诊断价值 血浆miR-182为1.365时，灵敏度为89.4%，特异度为79.5%，曲线下面积（area under curve，AUC）为0.902（95%可信区间：0.841～0.964），介于CEA和CYFRA21-1之间；CEA为3.45 ng/ml时，灵敏度为55.3%，特异度为97.4%，AUC为0.825（95%可信区间：0.739～0.911）；CYFRA21-1为2.815 ng/ml时，灵敏度为83%，特异度为87.2%，AUC为0.914。血浆miR-182联合CEA及CYFRA21-1时，AUC为0.995，灵敏度高达93.6%，特异度为97.4%。见图4。

图4 血浆m iR-182、CEA、CYFRA21-1及3者的联合ROC曲线

3 讨论

miR是一类内源性非编码小RNA，广泛存在于血液、痰、尿、粪便等临床标本中。健康者血浆miR来源于血细胞。肿瘤患者血浆miR的来源尚无定论，但一般认为与血细胞无关，可能来源于肿瘤细胞分泌、凋亡及破碎细胞的释放。血循环中的miR能稳定存在，尽管血液中有大量的RNA酶，具体机制尚不清楚，可能与血液中miR的存在形式有关，如外核体［7］、蛋白质复合体［8］等。血浆miR可反复冻融，且在室温、4℃环境可保持稳定性。血浆中的miR量虽少，但具有良好的稳定性，故可作为临床研究指标。

miR-182是miR-183家族成员之一，共同定位于人类7q31-34染色体。该区域也是染色体上的不稳定脆性区域，该区域DNA拷贝数的异常扩增，可能是导致肿瘤发生的重要因素［9］。miR-182有促癌基因活性，在肺癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌等组织中高表达，而在胃癌中表达降低。对于肺癌中miR-182表达的研究多见于组织学和细胞系，国外对于NSCLC患者血浆中miR-182报道［10-11］很少，国内尚无肺癌血浆miR-182表达的研究，仅有一篇肺癌血清学miR-182的研究［12］。

本研究采用实时荧光定量PCR法，检测47例NSCLC患者及39例健康者血浆中miR-182的表达水平。结果显示NSCLC组血浆miR-182水平明显高于对照组，且Ⅰ/Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期的患者血浆miR-182水平均亦明显高于对照组，但 miR-182的表达与肿瘤TNM分期不相关，这与报道［10-11］一致。Shen et al［11］用实时荧光定量PCR法同时检测NSCLC组织和血浆中miR-182的表达，进一步Spearman相关分析提示两者有明显的相关性（rs≥0.85，P＜0.01）。其他miR分子在非小细胞肺癌血清/血浆中也可异常表达，如miR-126［13］、miR-10b［14］等，其表达水平与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移及疾病预后有一定的相关性。Yang et al［15］发现，肺癌早期Sp1通过上调miR-182的表达，进一步抑制FOXO3表达，促进肺癌细胞的生长；肺癌晚期Sp1和miR-182表达下降，FOXO3表达上调，利于肺癌的转移。本研究进一步对NSCLC患者的临床特征分析显示NSCLC患者血浆miR-182的表达减低与肿瘤胸膜转移有关，这与研究［15］相符。

目前临床上常用的非小细胞肺癌标志物有CEA、CYFRA21-1等。CEA敏感性低，但特异性较高，尤其是对腺癌。CYFRA21-1对鳞癌有一定的诊断价值，但特异性欠佳。本研究结果显示血浆miR-182的ROC的AUC为0.872，敏感性高于CEA及CYFRA21-1，但特异性不高，3者联合可明显提高对NSCLC的诊断效能，灵敏度达93.6%，特异度为97.4%。因此，血浆miR-182对NSCLC有一定的诊断价值，联合CEA及CYFRA21-1可弥补单一检测的局限性。

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The level ofmiR-182 was 1.610（1.435，1.975）in NSCLC group，which was significantly higher than that in the control group（P＜0.01）.The expression ofmiR-182 showed a significant difference in pleuralmetastasis（P＜0.05），and therewas no significant difference in tumor size，pathological type，TNM staging and lymph nodemetastasis.When plasmamiR-182 was1.365，the sensitivity was89.4%，and the specificity was79.5%.The combination ROC analysis of CEA，CYFRA21-1 andmiR-182 revealed increased AUC value to 0.995 with 93.6%sensitivity and 97.4%specificity.Conclusion The plasma miR-182 level is up-regulated in NSCLC patients，which combined with CEA and CYFRA21-1 can remedy the limitation of the single detection.miR-182may be a potential novel biomarker for the diagnosis of NSCLC.

Expressions of p lasma m icroRNA-182 in non-small cell lung cancer and its clinical significance

Zhang Yanyan，Xu Aihui，Li Yonghuai，et al
（Dept of Respiration，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To investigate microRNA-182（miR-182）expressions in plasma of non-small cell lung cancer（NSCLC）patients and its clinical significance.Methods Real-time quantitative PCR（qRT-PCR）was employed to detectmiR-182 from the plasma of 47 NSCLC patients（NSCLC group）and 39 healthy controls（controlgroup）.Serum carcinoembryonic antigen（CEA）and cytokeratin 19-fragment（CYFRA21-1）were examined by chemiluminescence.The relationship between miR-182 expressions and clinicalpathological features was analyzed and receiver operating characteristic（ROC）curvewas drawn to assess the diagnostic value ofmiR-182.Resu lts

non-small cell lung cancer；plasma microRNA-182；qRT-PCR

R 734.2

A

1000-1492（2016）04-0583-04

2015-12-21接收

国家公益性行业科研专项（编号：201302003）

安徽医科大学第一附属医院1呼吸内科、2体检中心，合肥230022

张艳艳，女，硕士研究生；徐爱晖，女，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：xuaihui0909@163.com