85株儿童感染金黄色葡萄球菌耐药性及流行病学研究

夏小荣，熊玉玲，朱玉林，王亚亭

85株儿童感染金黄色葡萄球菌耐药性及流行病学研究

夏小荣，熊玉玲，朱玉林，王亚亭

目的 了解安徽省各地区近年儿童感染金黄色葡萄球菌（SA）耐药性及其流行病学特征，分析耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的葡萄球菌盒式染色体（SCCmec）基因型分布特点，为临床感染和控制提供依据。方法 临床分离2010年～2013年每年9月非重复的儿童SA共85株，利用Microscan Walk-Away-40全自动微生物分析仪进行细菌鉴定和药敏试验，MRSA经琼脂倍比稀释法进行表型筛选、聚合酶链反应（PCR）最终确定。多重PCR法检测MRSA SCCmec基因分型。结果 85株SA中检出19株MRSA和66株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA），MRSA的检出率为22.35%。MRSA检出率最多的标本是痰液及咽拭子，其次为分泌物。全部SA对青霉素、克林霉素完全耐药，未发现万古霉素耐药及中介的菌株。与MSSA药敏结果比较，MRSA对16种常用抗菌药物的耐药性更高。MRSA SCCmec分型以SCCmecⅢ最多见，共12株，其次为SCCmec I5株，未分型2株，未发现SCCmecⅡ、Ⅳ、Ⅴ型。结论 本地区儿童感染SA有不同的耐药谱，儿童MRSA对同种抗菌药物耐药率均高于MSSA。儿童临床分离的MRSA菌株其SCCmec基因型以Ⅲ型为主。临床应合理使用抗菌药物，定期监测耐药性变迁，避免院内传播。

儿童；金黄色葡萄球菌；耐药性；葡萄球菌盒式染色体；聚合酶链反应

网络出版时间：2016-3-8 8：29：02 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.054.htm l

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是儿科院内及社区感染重要的病原菌，其感染严重、病情多样变化、病死率高，给临床治疗带来了巨大困难。由于抗菌药物的广泛使用，儿童耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcusaureus，MRSA）感染分离率正逐年升高，细菌耐药性已成为临床上抗感染领域的严峻问题。为了解安徽省地区儿童感染SA对抗菌药物的耐药性及MRSA基因型分布特征，对2010年～2013年每年9月安徽省各地区医院儿童临床标本中分离的85株SA进行药敏试验，并采用多重聚合酶链反应（PCR）法分析MRSA分离株的基因分型。

1 材料与方法

1.1 菌株来源及质控菌株 85株SA收集自2010年～2013年每年9月安徽省细菌耐药中心监测网41所医院临床分离的非重复送检标本。质控菌株为安徽省细菌耐药监控中心标准菌株SA ATCC 25923、ATCC 29213和ATCC 43300（mecA阳性菌株）。

1.2 仪器、试剂和培养基 Microscan Walk-Away-40全自动微生物分析仪购自美国DADE公司；PCR仪器购自德国Biometra公司；凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司；多点接种仪购自英国AQS Manufacturing公司；电热恒温箱购自上海精宏公司；M-H琼脂培养基购自英国Oxiod公司；葡萄球菌溶菌素购自大连宝生物公司；PCR试剂盒：dNTP、Ex-Taq酶、Buffer、琼脂糖、DL 600、DL 2000等均购自上海生物工程公司。

1.3 抗菌药物 青霉素、苯唑西林、头孢吡肟、头孢他啶、头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻肟、亚胺培南、美罗培南、万古霉素、替考拉林、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素、氯霉素、利福平、红霉素、阿奇霉素、克林霉素共19种抗生素均购自中国药品生物制品检定所，均在有效期内使用。

1.4 药敏试验 采用琼脂倍比稀释法对分离株进行药物敏感性检测，结果判定按照美国临床实验室标准化委员会（CLSI）2013版指南标准［1］进行判定。

1.5 PCR法鉴定MRSA及SCCmec的多重PCR扩增分型 根据美国临床实验室标准协会标准，应用PCR法对SA菌株进行耐药基因的扩增即mecA基因，每次PCR均有 ATCC 43300阳性对照、ATCC 29213阴性对照及双蒸水作为空白对照，见图1。经药敏试验及PCR鉴定MRSA，其SCCmec复合扩增引物反应条件参考Zhang et al［2］的报道并做适当改变。SCCmec基因分型引物由上海生工工程有限公司合成，PCR引物序列及产物长度见表1。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像系统观察，并切取有效片段经上海生工工程有限公司测序，见图2。测序结果在Genbank比对，比对结果确定其为扩增产物，见图3。

图1 部分MRSA基因分型图谱M：Marker；1～7：受试　MRSA菌株；8：阳性对照菌株　ATCC 43300；9：阴性对照菌株 ATCC 29213；10：双蒸水对照

图2 部分 MRSA的 SCCmec多重PCR分型图谱M：Marker；1～3：SCCmecⅠ型的　MRSA；4～8：SCCmecⅢ型的MRSA

图3 测序图A：mecA；B：SCCmecⅠ型；C：SCCmecⅢ型

1.6 统计学处理 SA的分布及药敏数据采用SPSS 16.0软件进行分析，两组的比较采用χ2检验。

表1 PCR扩增引物序列

2 结果

2.1 MRSA分离情况 2010年～2013年每年9月共收集儿童金黄色葡萄球菌85株，其中MRSA 19株，检出率为22.35%（19/85）。

2.2 SA标本分离来源、病区分布及年龄分段 儿童SA标本主要来源最多见为痰液及咽拭子，占52.95%，分泌物次之为11.82%；经统计学分析表明，两标本来源所占比例比较差异有统计学意义（χ2=21.502，P＜0.05），见表2。病区分布多见于普儿内科，占43.53%，其次为儿外科为32.94%，两科室所占比例比较差异有统计学意义（χ2=4.243，P＜0.05），见表3。年龄段来源多见于婴幼儿，占51.77%，学龄期儿童次之为27.27%，两年龄段所占比例比较有统计学意义（χ2=13.306，P＜0.05），见表4。

表2 MSSA与MRSA临床标本来源构成比［n（%）］

2.3 SA的药敏结果分析 85株SA均对青霉素和克林霉素100%耐药；对头孢曲松、头孢他啶、大环内脂类耐药率高，为50.59%～82.35%；对氯霉素、左氧氟沙星、苯唑西林等耐药性较低，为20.00%～36.74%；对亚胺培南、利奈唑胺等耐药率低，为9.41%～15.29%；未发现对万古霉素耐药株。除青霉素、克林霉素和万古霉素外，MRSA与MSSA对其余16种抗菌药物均有不同程度耐药，且MRSA的耐药率均高于MSSA，见表5。

表3 MSSA与MRSA临床科室分布构成比［n（%）］

表4 M SSA与　MRSA年龄段来源分类构成比［n（%）］

表5 M RSA与　MSSA对常见抗菌药物的耐药性

2.4 MRSA的SCC基因分型结果 19株MRSA分离株SCCmec分型共有Ⅰ、Ⅲ型两型，其中Ⅲ型为最常见的SCCmec型，占63.16%（12/19）；其次是Ⅰ型，占26.32%（5/19）；未分型的2株，占分离株的10.53%（2/19）。

3 讨论

随着抗菌药物的广泛使用，儿童SA感染的分离率呈逐年上升趋势，是医院感染的重要病原菌，并常有暴发流行的报道。本研究结果显示，我省儿童MRSA分离率为22.35%，与近年国内文献［3-6］报道的儿童感染资料相近。朱德妹等［3］对国内主要地区14所教学医院（12所综合性医院、2所儿童医院）临床分离的SA菌株采用统一方案进行细菌药敏试验，报道［3-7］显示MRSA居历年革兰阳性菌分离株的首位，2010年报道上述医院共收集SA 4 452株，MRSA的平均检出率为51.7%（11.5% ～77.6%），儿童专科医院MRSA的检出率为11.5% ～24.5%［4］。2011年报道 SA 6 000株，MRSA平均检出率为50.6%（20.2%～85.3%），儿童为20.2% ～27.7%［5］。2012年报道SA 7 339株，MRSA平均检出率为47.9%（18.4%～82.9%），儿童为18.4% ～29.4%［6］。2013年报道 SA 8 127株，MRSA平均检出率为45.2%（23.8%～72.0%），儿童为23.8% ～37.6%［7］。不同地区或医院间、成人和儿童MRSA的检出率比较有差异，可能与用药习惯、标本来源、研究菌株例数、研究方法等密切相关。

本研究显示，安徽省各级医院收集分离的85株SA主要分离自呼吸道标本痰液和咽拭子，占所有临床送检标本的52.95%。其次为分泌物，占18.82%，其他来源标本占28.23%。提示临床上要加强对儿童患者呼吸道感染好发部位的监测与护理，是预防与控制临床感染的重要途径。从临床来源各科室分布看来，儿内科和儿外科尤其骨科检出率居多，分别为43.53%和 32.94%，提示加强医院里重点高危科室的综合管理，对防止SA医院内感染的爆发流行极为重要。从年龄段分布来看，SA所致的感染在学龄前期（3～6岁）较少，所占比例为4.71%，而在婴幼儿和学龄期儿童多见，分别为51.77%和27.05%。这与儿童的年龄特点相关，婴幼儿的自身免疫功能尚未发育成熟，皮肤黏膜等非特异性免疫屏障功能薄弱，抗感染能力较差，易发生各种感染，而学龄期儿童经常参加比较剧烈的体育运动或户外活动，外伤后易继发感染［8］。

药敏结果显示，85株SA未发现对万古霉素耐药株，对替考拉林、美罗培南、亚胺培南耐药率低，表明这些药物是SA感染患儿治疗首选和有效的药物，临床在使用时应做好耐药性监测，避免滥用。氯霉素、利福平、左氧氟沙星、庆大霉素耐药率较低，表明这些药物对SA仍具有较好的抗菌活性，提示这些抗菌药物在药敏结果未出来而SA感染较重时，可以优先考虑使用，待药敏结果再行调整。大环内酯类、克林霉素、头孢他啶、头孢曲松耐药率高，表明目前这些抗菌药物已不适用于治疗SA引起的儿童感染。本研究SA药敏结果与李颖丰等［9］报道药敏结果相比较显示，两者都对万古霉素完全敏感，对青霉素完全耐药，其次对亚胺培南、美罗培南的耐药率低，而对其他抗菌药物的耐药率均有所增高。

本实验药敏结果进一步显示，MRSA和MSSA对苯唑西林、头孢曲松、头孢吡肟、头孢噻肟、环丙沙星、庆大霉素耐药率比较，差异均有统计学意义。这些抗菌药物对MSSA有较好的治疗效果，而对MRSA耐药率高，所以在未确定SA是否为MRSA的情况下，临床上不建议首选这些抗菌药物。头孢他啶、大环内酯类抗菌药物在两组中比较差异无统计学意义；这些抗菌药物耐药率均在50%以上，无论SA是否为MRSA，临床上均不予考虑使用。利福平、左氧氟沙星、氯霉素等其他7种抗菌药物的耐药率均在50%以下，表明在临床SA感染较重时而药敏结果未归时，可以考虑使用这些抗菌药物。临床上在确诊SA感染时，应区别对待MRSA和MSSA，根据药敏结果及时、合理使用抗菌药物预防和控制感染。

目前认为MRSA的耐药机制是MSSA在获得了SCCmec元件，此SCCmec元件上mecA基因编码产生青霉素结合蛋白（PBP2a），对β-内酰胺类抗菌药物的亲和力降低，从而产生对抗菌药物的耐药［10］。在世界不同地区MRSA菌株携带的SCCmec类型的流行趋势亦不尽相同，亚洲地区MRSA菌株携带Ⅱ型SCCmec基因型主要见于日本和韩国，其他大多数地区MRSA菌株以携带Ⅲ型的SCCmec［11］为主。我国各地学者［12-14］对当地分离的MRSA SCCmec基因检测分析结果表明，我国分离的MRSA携带的SCCmec基因型也以Ⅲ型为主，同时也有不同比例的其他类型SCCmec存在。本研究对所检测的19株 MRSA进行SCCmec扩增分型，结果表明SCCmecⅢ型的MRSA为12株，SCCmec I型的MRSA为5株，未分型的2株，说明引起本地区感染的MRSA以SCCmecⅢ型为主，和国内报道一致。

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Antim icrobial resistance and epidem iology of 85 isolates of Staphylococcal aureus infection in paediatrics

Xia Xiaorong，Xiong Yuling，Zhu Yulin，et al
（Dept of Paediatrics，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

Objective To investigate the antimicrobial resistance and the epidemiological characteristics of Staphylococcusaureus（SA）.To analyze themethicillin-esistant SA（MRSA）staphylococcal cassette chromosome（SCCmec）genotype distribution characteristics，so as to provide evidence for clinical infection and control.Methods A total of85 clinical isolatesof SA were consecutively collected from different clinical significance specimens，and were excluded the repeated isolates from the same patients.All isolates SA and drug sensitivity testwere identified by the Microscan Walk-Away-40 automaticmicroorganism analyzer.The MRSA wasmade by agar dilutionmethod for phenotype screening and further identified by polymerase chain reaction（PCR）.The genotypes of SCCmec were determined bymultiplex PCR.Resu lts Of 85 strains isolated SA，there were 19 strains MRSA and 66 strainsmethicillin sensitive SA（MSSA）.The detection rate ofMRSA was22.35%.Themain detection rate ofMRSA specimens was sputum and throat swab，followed by secretions.All SAwere completely resistant to penicillin and childamycin，but entirely sensitive to vancomycin.Compared with MSSA，the drug resistance of16 common antimicrobial agengts was higher than that of MRSA.SCCmec genotyping results showed that themost frequent SCCmec type wasⅢ.The 12 isolates of MRSA were SCCmecⅢ，only 5 isolateswere SCCmecⅠ，and 2 isolates had no genotype.TypeⅡ，typeⅣand typeⅤwere not found in the group.Conclusion There are different resistance patterns of SA in the local area.The rates of drug resistance of MRSA for children are higher than those of MSSA.The main SCCmec genotype of MRSA in children is SCCmecⅢ.Clinician should use antimicrobial drugs rationally，and furthermore，we should regularlymonitor the change of resistance and preventnosocomial transmission.

children；Staphylococcus aureus；antimicrobial-resistance；staphylococcal cassette chromosome mec；polymerase chain reaction

R 446.5

A

1000-1492（2016）04-0574-05

2015-12-08接收

安徽省自然科学基金（编号：1408085QH157）

安徽医科大学第一附属医院儿科，合肥 230022

夏小荣，女，硕士研究生；
王亚亭，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：wangyating@163.com