高糖诱导人肾近曲小管上皮细胞凋亡及其调控机制

袁育珺，段惠芳，胡志坚，汪 渊

高糖诱导人肾近曲小管上皮细胞凋亡及其调控机制

袁育珺1，段惠芳2，胡志坚1，汪 渊3

目的 研究高糖诱导人肾近曲小管上皮细胞凋亡及其调控机制。方法 以人肾近曲小管上皮细胞株HK-2为研究对象，随机分为对照组、高糖组、甘露醇组。MTT、流式细胞术观察细胞的增殖和凋亡状况；ELISA法检测细胞内Caspase的活性；Western blot法分析B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）及Caspase家族蛋白的表达变化。结果 与对照组比较，高糖组能抑制HK-2细胞的体外增殖，下调抑制凋亡作用的蛋白Bcl-2表达，上调促凋亡作用的蛋白Bax、Bak表达（P＜0.05）；流式细胞术显示HK-2细胞周期有明显的变化，且随葡萄糖浓度的升高中期凋亡和末期凋亡所占的比例明显上升（P＜0.01），并且Caspase酶原降解及活性表达也呈上升趋势（P＜0.01）。结论 高糖能抑制HK-2细胞体外增殖，并诱导其凋亡，其机制可能是通过Bcl-2及Caspase家族调控HK-2细胞的凋亡。

高糖；HK-2；凋亡；表达

网络出版时间：2016-3-8 8：29：01 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.018.htm l

细胞凋亡是生理性过程，不同于细胞坏死；凋亡细胞能产生吞噬和清除碎片的凋亡小体，避免周围环境中细胞损害，维持内环境稳定［1］。糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）发病机制复杂，DN早期，肾脏通过细胞凋亡等应急反应来清除过度增殖的内皮细胞，维持内环境稳定；DN晚期，随着肾功能障碍，内环境稳态破坏，细胞凋亡过度，致使肾损害也加剧［2-3］。了解和干预肾小管内皮细胞凋亡有助于延缓DN进展。该研究采用体外培养人肾近曲小管上皮细胞株HK-2细胞，分析高糖坏境下HK-2细胞的增殖和凋亡状况、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）及Caspase家族蛋白表达的变化，并进一步探讨这些作用可能的分子调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料 低糖（5.5 mmol/L）DMEM（美国Gibico公司）；D-glucose、医用甘露醇（北京国药集团公司）；Gibco原装小牛血清（北京索莱宝科技有限公司）；HK-2由中国科学技术大学生命科学院赠送，液氮保存；Annexin V-FITC（安徽碧云天生物试剂公司）；一抗actin、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax、Bak、Caspase-7（美国Santa Cruz公司）；MTT（美国Sigma公司）；二抗（美国Pierce公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分组 液氮取出HK-2细胞，37℃水浴解冻，迅速接种于含10%小牛血清低糖DMEM（葡萄糖浓度5.5 mmol/L），37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中。胰酶消化传代，备用。分组：对照组（葡萄糖浓度为5.5 mmol/L）、高糖组（葡萄糖浓度分别为25、40 mmol/L）和甘露醇组（葡萄糖浓度5.5 mmol/L+甘露醇浓度分别为19.5、34.5 mmol/L）。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖 取生长旺盛的HK-2细胞，胰酶消化，按1.2.1分组，MTT实验严格按照前期报道［4］操作，实验重复3次。

1.2.3 Annexin V-FITC分析细胞凋亡 取对数期生长的HK-2细胞，胰酶消化传代，制成细胞悬液，取合适的量平均接种于6孔板，次日按1.2.1分组，37℃刺激48 h，各组胰酶消化制成约1×106个/ml细胞悬液。400μl Annexin V结合液重悬，加入5μl Annexin V-FITC染色液，2～8℃避光孵育15 min。4℃冷冻离心5 min（10 000 r/min），去除上清液，再用400μl Annexin V结合液重悬，10μl/孔PI染色液，震动器轻轻混匀；锡箔纸包裹置冰上孵育5 min，然后上机检测。

1.2.4 Caspase蛋白酶原活性检测 原理：依据ELISA抗原抗体结合的原理，细胞内活性的Caspase-7、Caspase-3、Caspase-9能在体外与相应的酶结合，催化底物显色反应，通过吸光度（optical density，OD）值OD405来间接反应Caspase-7、Caspase-3、Caspase-9的活性。取对数期生长的HK-2细胞，按1.2.3步骤操作，分组后置于培养箱连续刺激2 d，胰酶消化，冷冻离心5 min（10 000 r/min），按照ELISA法操作，依次加入酶、底物、酶标仪检测，实验重复3次。

1.2.5 Western blot法检测 提取总蛋白：按1.2.1分组批量培养，刺激48 h后，弃去原液并用PBS洗去残留液体，置冰上，每瓶加裂解液150μl充分裂解，细胞刮子收集细胞，低温冷冻离心5 min（10 000 r/min），上清液置于-80℃备用，BCA测定蛋白浓度，每组加入浓缩蛋白上样缓冲液，水浴煮沸，分装备用，置于 -20℃保存。配制12.5%SDS-PAGE，微量加样针上样，先用40～50 V电泳浓缩胶，100 V电泳分离胶，100 mA冰浴转膜，伊利脱脂牛奶封闭，PBS洗膜，置于一抗为Bcl-2（1∶400），Caspase-7（1 ∶1 000），Bak（1∶1 000），Bax（1∶300），Caspase-3 （1∶2 000），Caspase-9（1∶800），actin（1∶1 000），4℃过夜。相应二抗分别为山羊抗小鼠（1∶1 500），山羊抗鼠（1∶1 500），山羊抗兔（1∶1 000），山羊抗鼠（1∶1 000），山羊抗鼠（1∶1 000），山羊抗兔（1 ∶1 000），山羊抗小鼠（1∶4 000），37℃孵育2 h，PBS洗膜3次，暗室内胶片显影、定影，重复实验3次。结果进行统计学分析。Western blot条带的灰度值用Image Pro 4.5分析软件测定。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计学单因素方差分析，数据用±s表示。组间计量资料用方差分析。

2 结果

2.1 高糖对HK-2细胞的体外增殖的影响 MTT

结果采用单因素方差分析进行主体间效应检测，显示差异有统计学意义（F=112.04，P＜0.01）。组间两两比较显示，与对照组比较，高糖组（25、40 mmol/ L）的OD值依次降低，且糖浓度为40 mmol/L抑制率达26.6%（P＜0.05，P＜0.01）；而甘露醇组与对照组比较，差异无统计学意义，表明体外高糖能抑制HK-2细胞的体外增殖，与高晶体渗透压无关。见表1。

表1 不同浓度葡萄糖对HK-2细胞的增殖的影响（n=5）

图1 Annexin V-FITC检测高浓度葡萄糖对　HK-2细胞凋亡的影响A：对照组；B：25 mmol/L葡萄糖；C：40 mmol/L葡萄糖；D：5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇；E：5.5 mmol/L葡萄糖 +34.5 mmol/甘露醇

2.2 高糖对HK-2细胞凋亡的影响 结果采用单因素方差分析进行主体间效应检测，差异有统计学意义（F=82.54，P＜0.01）。组间两两比较显示：与对照组（9.9%）比较，高糖组（图1B、1C）中期凋亡与末期凋亡所占的比例明显升高，并且末期凋亡所占的比例随着葡萄糖浓度的升高而升高；从图1D、1E中可以观察到甘露醇对细胞的凋亡影响不明显。提示高糖能诱导HK-2细胞凋亡，与高晶体渗透压无关。见图1、表2。

2.3 高糖对Caspase蛋白酶原活性的影响 单因素方差分析显示高糖能够增强Caspase-7、Caspase-3、Caspase-9活性（F=71.43、55.81、74.32，P＜0.01）。组间两两比较显示：与对照组比较，高糖组Caspase-7、Caspase-3、Caspase-9活性呈上升趋势，但甘露醇组活性没有明显变化。见图2。

2.4 高糖对Bcl-2及Caspase蛋白酶原家族蛋白表达的影响 单因素方差分析显示高糖上调Bak、bax、cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-7蛋白表达（F=27.41、47.54、37.22、41.77、25.47，P＜0.01）；下调Bcl-2蛋白表达（F= 33.14）。组间两两比较显示：与对照组比较，Bcl-2家族Bcl-2蛋白表达量有所下降，Bak、Bax蛋白表达量显著上升，且Bax/Bcl-2的比值也呈上升趋势。另外剪切后的Caspase蛋白酶原家族cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-7蛋白表达明显增加，见图3。

图2 Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9活性检测（n=4，±s）A：Caspase-7；B：Caspase-3；C：Caspase-9；1：对照组；2：5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇；3：5.5 mmol/L葡萄糖　+34.5 mmol/甘露醇；4：25 mmol/L葡萄糖；5：40 mmol/L葡萄糖；与对照组比较：**P＜0.01

图3 高浓度葡萄糖对HK-2细胞相关凋亡蛋白表达的变化A：对照组；B：25 mmol/L葡萄糖；C：40 mmol/L葡萄糖；与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

表2 不同浓度葡萄糖对HK-2细胞周期的影响（%）

3 讨论

DN是糖尿病重要并发症之一，其基本病理特征主要表现为肾小球细胞外基质聚集与降解紊乱，导致肾小球病态增生、基底膜增厚和动脉硬化等，这些改变严重影响肾小管的营养供应，诱发上皮细胞程序性凋亡，从而导致肾间质纤维化［5］。国外相关报道［6］证实终末期肾病肾小球损伤多数从肾小球上皮细胞（足细胞）损伤开始；在糖尿病的早期，长期处于高糖环境下的细胞微环境发生改变，导致肾小球超过滤、诱发氧化应激、糖化终产物堆积、蛋白激酶C的激活、多元醇化、转化生长因子的过表达和炎症等，这些因素致使肾小管基底膜增厚，养分供应受阻，引起肾小管上皮细胞萎缩，导致肾衰竭。因此干预肾小管上皮细胞凋亡，维持上皮细胞活性，能有效的减缓肾脏的衰竭［5］。

体内长期高血糖容易导致上皮、内皮细胞损伤和功能障碍，从而诱发多种疾病，如2型糖尿病等；因此，控制血糖，并通过调节细胞增殖和凋亡修复损伤的细胞有重要的临床意义［7-8］。本研究模拟体内高糖环境，选取稳定性较好的人肾近曲小管上皮细胞株HK-2进行体外培养。作为维持近曲小管功能的上皮细胞，HK-2细胞的功能障碍在DN的发生发展中扮演着重要角色。实验表明高糖刺激48 h后HK-2细胞的增殖抑制，且出现细胞凋亡现象。

Bcl-2家族和Caspase共同参与调控细胞凋亡［9-10］。Bcl-2家族通过调控Bcl-2与Bax、Bak之间的比例，改变线粒体膜的通透性释放细胞色素C等促凋亡蛋白［11-12］，诱导细胞凋亡。而Caspase家族分工协作，Caspase-9感受线粒体发出的死亡信号；Caspase-3属于凋亡效应子，能直接引起细胞凋亡；Caspase-7能促使ROS表达，诱导内质网应激，参与细胞凋亡［13-15］。本实验Western blot结果表明HK-2细胞内Bcl-2家族和Caspase家族均被激活，表现为Bcl-2蛋白表达量下降，Bak、Bax蛋白表达量上升，且Bax/Bcl-2的比值也呈上升趋势。另外Caspase蛋白酶原家族Caspase-9、Caspase-3、Caspase-7酶原降解及活性表达也呈上升趋势。推测高糖可能是通过某种途径激活Bcl-2家族，释放细胞色素C，引起Caspase酶原降解，活化Caspase家族启动级连反应，诱导HK-2细胞发生凋亡。详细机制有待进一步研究。

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High glucose can inhibit the proliferation of HK-2 cells in vitro and induce its apoptosis，and itsmechanism may regulate the apoptosis of HK-2 cells through Bcl-2 and Caspase families.

Apoptosis of HK-2 cells induced by high glucose and its regulation mechanism

Yuan Yujun1，Duan Huifang2，Hu Zhijian1，et al （1Clinical Laboratory，2Medicare Office，The Affiliated Hospital of Jiujiang University，Jiujiang 332000）

Objective To investigate high glucose-induced apoptosis in HK-2 cells and its possible regulation mechanism.Methods HK-2 cells were divided into three groups and treated as follows：normal group，high glucose groups，mannitol groups.The cell proliferation and apoptosis of HK-2 cellwas analyzed by MTT，flow cytometry.The expression of Bcl-2 and Caspase family proteins were studied by Western blot，and the activity of Caspase family was analyzed by ELISA.Resu lts High glucose could inhibit growth of HK-2 cells.Moreover，high concentrations of glucose could also induce apoptosis with the concentration increased more obviously（P＜0.01）.Western blot showed that high glucose down-regulated Bcl-2，increased Bak，Bax expression（P＜0.05）.Conclusion

high glucose；HK-2；apoptosis；expression

R 735.7

A

1000-1492（2016）04-0497-05

2016-01-08接收

国家自然科学基金（编号：81272399）

九江学院附属医院1检验科、2医保办，九江 332000
3安徽省/省部共建教育部重要遗传病基因资源利用重点
实验室，合肥 230032

袁育珺，男，硕士；
汪 渊，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：wangyuan@ahmu.edu.cn