采用BP神经网络优化酱油固态酿造条件

冷云伟，徐　岩

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.中国矿业大学 生物工程学院，江苏 徐州221008）

采用BP神经网络优化酱油固态酿造条件

冷云伟1，2，徐岩1*

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.中国矿业大学 生物工程学院，江苏 徐州221008）

酱油是一种中国传统发酵调味品。酱油的生产机理主要利用米曲霉所产的蛋白酶分解原料蛋白质为氨基酸，通过后期发酵增香，经淋油、灭菌、勾调而成。作者研究了米曲霉产蛋白酶在不同温度、pH、盐分条件下的特性，并且利用BP神经网络对蛋白酶最佳作用条件进行了优化。结果表明：最佳作用条件为42℃，pH 7.0，盐度为0°Bé。以该结果为基础，进行规模化实验。结果表明：车间试验发酵条件确定为温度42℃，全程盐度18°Bé，加盐水比为1∶2，淋浇次数为3 次/d。

米曲霉；蛋白酶活力；酱油；神经网路；固态酿造

我国目前主流的酱油生产工艺主要有两种：一种是低盐固态发酵，另一种是高盐稀态发酵，其中前者占到80%左右。而两种发酵方式都存在各自的缺点：低盐固态虽然发酵周期短，但是原料蛋白质利用率不高，产品风味不好；高盐稀态发酵发酵周期过长，劳动强度大，不适合大规模生产［1-4］。因此，寻求一种合适的发酵方式来提高酱油原料利用率、提高酱油风味同时缩短发酵周期，已成为急需解决的问题［5-8］。由于酱油发酵的主要菌种是米曲霉，利用该菌种生产的成曲主要分泌碱性、中性和酸性蛋白酶，研究蛋白酶作用的最佳条件是提高蛋白质利用率的主要方式［9-15］。

作者主要针对生产用酱油曲精所生产的成曲进行蛋白酶的粗提取，根据所产蛋白酶在不同温度、盐分和pH条件下的酶活数据，确定蛋白酶的最佳作用条件。利用神经网络模型对实验条件进行深入优化，得出最优条件，并在此优化的基础上对放大规模最优酱油发酵条件进行研究。

1材料与方法

1.1成曲蛋白酶液的分离提取

成品曲由江苏恒顺万通食品酿造有限公司提供。称取充分研细的成曲5 g，加水至100 mL，在40℃水浴内间断搅拌1 h，过滤，滤液用0.1 mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液稀释到一定倍数。

提取酸性和碱性蛋白酶时，各自加入相应倍数的pH 3.0的乳酸缓冲液和pH 10.0的硼酸缓冲溶液。

1.2蛋白酶酶活力的测定

采用改进的福林酚法［17］，取试管3支，每管加入酶液稀释液1 mL，置于40℃水浴中预热2 min，再加入经同样预热的酪蛋白1 mL，精确保温10 min，时间到后，立即再各加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL，以终止反应，继续置于水浴锅中保温20 min，使残余蛋白质沉淀后过滤。另取试管3支，每管加入滤液1 mL，再加入0.4 mol/L碳酸钠5 mL，已稀释的福林试剂1 mL摇匀。40℃保温发色20 min后测定吸光值。

空白试验也取试管3支，测定方法同上，在加酪蛋白之前先加0.4 mol/L三氯乙酸2 mL，使酶失活，再加入酪蛋白。酶活力计算：在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1 ug酪氨酸定义为1个蛋白酶活力单位（U）。

式中：A为样品的净吸光值，由标准曲线得相当的酪氨酸微克数；4为4 mL反应液取出1 mL测定；N为酶液稀释倍数；10为反应10 min；w为样品水分质量分数。

1.3温度对成曲溶液酶活力的影响

鉴于温度敏感性是米曲霉产蛋白酶的一个重要特性，设定盐度为0°Bé、pH 7.5恒定，在25、30、35、40、45、50、55℃下精确保温30 min，再调温至40℃测定酶活力，以温度为横坐标，以相应的酶活力为纵坐标，即可求得酶反应的最适温度。

1.4盐度对成曲溶液酶活力的影响

盐分在发酵生产过程当中主要起调味和抑制杂菌生长的作用，但是也会抑制蛋白酶的酶活。通过保持温度40℃、pH 7.5不变的情况下，在0、5、10、15、20、25°Bé的盐度下保持30 min，测定酶活力，可以了解到不同盐分对蛋白酶的抑制程度。

1.5pH对成曲溶液酶活力的影响

pH不仅对酶活性有很大的影响，而且对酶的稳定性也有很大的影响。将提取的酶液分成5份，分别置于pH为3、5、7、9、11缓冲溶液中保温处理30 min，然后再调至pH 7.5测定酶活力。

1.6BP（Back Propagation）神经网络对各因素的学习训练

人工神经网络是近年来发展的一门前沿科学，已成为数学建模领域的一个热点并在工程领域得到了较为广泛的应用［17-18］。作为一个非线性动态系统，人工神经网络具有很强的自学习和自适应能力，使得它适于处理在已知条件和结果之间无明确数学关系的数据，并能够在条件与结果之间建立一定的关系。

对于蛋白酶反应条件和酶活大小的对应关系，现在来说还是一个盲区，或者说很多时候都是以经验为主，利用BP神经网络刚好可以模拟此过程，进行深入优化。

以温度、盐度和pH为输入层的三个因素，以对应条件下的蛋白酶酶活为输出层因素，通过对单因素数据的不断正向训练和反向传播，不断更改隐含层各节点的权值，得出模拟结果。网络结构见图1。

图1　BP神经网络训练结构图Fig.1　Trained BP neural network structure diagram

2结果与讨论

2.1单因素实验结果与讨论

2.1.1温度对成曲蛋白酶酶活力的影响根据实验所得数据，做出成曲溶液酶活力随温度的变化趋势图，见图2。在其他的条件不变时，温度对蛋白酶的影响极大，最低到620 U/g。而在最适温度38℃时，酶活可以达到1 550 U/g。中性蛋白酶在36℃左右酶活最大，而碱性蛋白酶和酸性蛋白酶略低，在37℃左右。所以，在酱油发酵时，前期要保持在35～40℃之间，利于蛋白质的分解利用。

图2　温度对成曲蛋白酶酶活力的影响Fig.2　Effects of temperatures on the enzyme activity

2.1.2盐度对成曲蛋白酶酶活力的影响根据实验所得数据做出随盐度的变化，蛋白酶酶活力的变化趋势见图3。盐分主要在酱油发酵过程中对蛋白酶的影响主要是负面的。

在盐度从0°Bé到10°Bé时，中性蛋白酶酶活下降较为快速，之后趋于缓慢。食盐浓度的增加对3种酶都产生抑制作用，该抑制作用随盐度的增加而更加显著。

图3　盐度对蛋白酶酶活力的影响Fig.3　Effects of salinity on enzyme activity of protease

2.1.3pH对成曲蛋白酶酶活力的影响根据实验所得数据，做出酶活随pH的变化趋势，见图4。可以看出，蛋白酶的最适作用pH在7左右，偏酸或偏碱都会影响蛋白酶的总体酶活，呈“倒钟”形。pH较低时，酸性蛋白酶酶活力较高，但是因为在整体酶系中，酸性蛋白酶含量较少，而此时中性和碱性蛋白酶酶活减少，应控制总酸，抑制变酸。

图4　pH对蛋白酶酶活力的影响Fig.4　Effects of pH on the enzyme activity

2.2BP神经网络对不同作用参数的研究探讨

利用训练好的BP神经网络对已做实验数据进行验证，见表1。

可以看出，网络对已测值的模拟误差在0.5%～6%波动，基本上很稳定，可以利用训练好的网络对影响因素进行进一步的优化。

表1　　蛋白酶活力网络模拟值和实测值的比对Table 1　Protease activity network simulation value and test value

本实验采取温度区间为 36、38、40、42、44、46℃；pH为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，利用训练好的网络进行优化，结果见图5—7。

图5　酸性蛋白酶网络条件优化结果Fig.5　Optimization results of acid protease networkcondition

由图5可知，网络所模拟的酸性蛋白酶在限制区间下，在36℃、pH 5.5具有最高酶活，随着温度和pH的升高，酶活快速下降。

图6　中性蛋白酶神经网络条件优化结果Fig.6　Optimization results of neutral protease network condition

由图6可知，中性蛋白酶的最佳作用条件是42℃、pH 7.0，在偏酸和温度偏高的条件下，酶活力下降较快。

由图7可以看出，碱性蛋白酶在温度42℃、pH 为7.0时，有最佳的蛋白酶活性，在偏酸和温度较低的条件下酶活下降较快。

图5-7均为网络模拟结果，采用最优条件再次实验，结果超出文献参考值，见表2。

图7　　碱性蛋白酶神经网络条件优化结果Fig.7　Optimization results of alkaline protease neural network condition

由表2可以看出，通过神经网络训练，酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶酶活均有了显著提高，分别比优化前提高了101.4%，52.8%，和33.6%，而且均高于文献值。

2.3车间发酵试验

车间共进行了三批共6大罐发酵试验。确定的试验工艺参数为：原料配比为豆粕∶麸皮=6∶4，盐水浓度18°Bé，发酵作用温度为40、45、50℃，加盐水比为1°2，淋浇次数为3次/d。

发酵过程中不同温度条件下的氨基酸态氮和总酸的变化情况见图8。从氨基酸态氮的变化曲线可以看出，40～50℃条件下，温度对氨基酸态氮的影响不明显；发酵前期氨基酸态氮增长都较慢，但逐渐增长，蛋白质分解时间较长，同时利于其他微生物的生长，利于后期生香；总酸的变化曲线显示，45℃最适于生酸，进一步提高温度，生酸变缓，而且催化产物产生高峰较早出现，并且峰值较低。

图8　　车间发酵不同温度条件下氨基酸和总酸变化Fig.8　AN and total acid change in workshop fermentation condition under different temperature

3结语

通过单因素试验，得出了米曲霉产蛋白酶的最佳作用条件是：38℃、pH 7.0、盐度为3°Bé。通过BP神经网络的优化，得出了米曲霉产蛋白酶的作用条件应为：42℃、pH 7.0、盐度为0°Bé。因为盐度对蛋白酶酶活具有抑制作用，所以在单因素试验过程中，未添加盐分。通过对网络模拟条件的实际操作，得出实验结果也较单因素阶段有较大提高。结合生产实际，修正部分工艺参数后，进行了三批共6大罐发酵试验。确定的试验工艺参数为：原料配比为豆粕∶麸皮=6∶4，盐水浓度18°Bé，发酵作用温度为45℃，加盐水比为1∶2，淋浇次数为3次/d。

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Study on the Optimization of Solid State Fermentation Conditions of Soy Sauce by Using BP Neural Network

LENG Yunwei1，2，XU Yan1*
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Department of Biological Engineering，China University of Mining and Technology，Xuzhou 221008，China）

Soy sauce is a kind of Chinese traditional fermented condiment.The main mechanism of soy sauce production is the decomposition of raw protein into amino acids using protease formed by Aspergillus oryzae，and the late fermentation flavor，shower oil，sterilization and blending into.This paper studies the characteristics of the protease formed by Aspergillus oryzae in different temperature，pH and salinity conditions analysis，and by using BP neural network to optimize the protease hydrolyse conditions.The results show：the best effect condition of 42℃，pH 7.0，salinity is 0°Bé.With the above research results as the foundation，carries on the scale of the experiment，the results showed that：the shop tests the optimal fermentation conditions for a temperature of 42℃，the whole salinity 18°Bé，and salt water ratio is 1∶2，pouring 3 times/day.

Aspergillus oryzae，protease，soy sauce，neural network，solid state fermentation

TQ 920.1

A

1673—1689（2016）05—0471—06

2014-10-17

国家863计划项目（2012AA021301；2008BAI63B07）。
*

徐岩（1962—），男，浙江慈溪人，工学博士，教授，博士研究生导师，主要从事酿酒科学与酶技术方面的研究。E-mail：yxu@jiangnan.edu.cn