中医“同病异证”理论在老年期痴呆两个典型证候的Tau蛋白脯氨酸富集区磷酸化位点的体现

郭　斌，郭　蕾，韩　诚，师卫斌（山西中医学院，山西太原030024）

中医“同病异证”理论在老年期痴呆两个典型证候的Tau蛋白脯氨酸富集区磷酸化位点的体现

郭斌，郭蕾，韩诚，师卫斌
（山西中医学院，山西太原030024）

目的：观察老年期痴呆病证结合肾虚精亏证大鼠模型与痰浊阻窍大鼠模型Tau蛋白在脯氨酸富集区磷酸化位点的情况，分析磷酸化的特异性。方法：采用隔周结扎双侧颈总动脉及切断术，随后腹腔注射D-半乳糖，建立老年期痴呆病大鼠模型；随后在疾病模型的基础上分别进行房劳水劳刺激和投喂高脂乳剂的刺激，建立相应的病证结合老年期痴呆大鼠模型。最后采用免疫印迹方法观察Tau蛋白在脯氨酸富集区Thr181、Thr205、Thr231、Ser262磷酸化位点的异常磷酸化状况。结果：在Tau蛋白脯氨酸富集区，与老年期疾呆组相比，病证结合痰浊阻窍证组主要在205和231位磷酸化水平显著增强，病证结合肾虚精亏证组主要在181，205，231位磷酸化水平显著增强。结论：老年期痴呆各典型证候在Tau蛋白脯氨酸富集区的磷酸化位点上有特异性，揭示了“同病异证”理论的科学内涵。

老年期痴呆；证候；病证结合；Tau蛋白磷酸化位点

“同病异证”是传统中医文化中的一个理论特色，也是对于理解病证关系的一个重要问题。人们通过基因组学、蛋白组学、代谢组学等科学方法对人体整体因素及体质因素进行分析，科学地深化“同病异证”的内容，从而促进人们对于病证关系的理解，最终完善了中医的现代化，使得中医与西医相结合，指导临床诊断治疗。近30余年对老年期痴呆证的研究取得了很大进展里，其中一个里程碑式的发现就是Tau蛋白的异常过度磷酸化是在以Tau蛋白异常沉积于神经元中为特征的神经原纤维退行性病变中的关键因素［1-2］。本文试图从Tau蛋白异常磷酸化方面来探讨老年期痴呆病证结合两个典型证候（肾虚精亏证和痰浊阻窍证）在脯氨酸富集区磷酸化位点上（Thr181、Thr205、Thr231、Ser262）的特异性，从而验证中医“同病异证”的科学内涵。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物选用成年健康SPF级SD雄性大鼠90只，体质量（240±20）g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK-（军）2007-004。实验前将动物进行1 w适应环境性饲养，室温（22±2）℃，自然光照，自由进食、饮水。

1.1.2药品与仪器D-半乳糖（美国Amresco公司）；BCA蛋白定量试剂盒（北京威格拉斯试剂公司）；ECL超敏发光液（北京普利莱基因公司产品）；DAB显色液、封闭用正常羊血清、生物素化羊抗兔二抗（北京中山金桥生物科技公司）；Tau Antibody （c-17）：sc-1995（美国Santa Cruz Biotechnology公司）；p-Tau Antibody（Ser262）：sc-101813（美国Santa Cruz Biotechnology公司）；Anti-Tau（Phospho S404）antibody（ab131338）（英国Abcam公司）；p-Tau Antibody（Ser396）：sc-101815（美国Santa Cruz Biotechnology公司）；p-Tau Antibody（Thr181）：sc-101816（美国Santa Cruz Biotechnology公司）；Anti-Tau（Phospho T231）antibody（EPR2488）（ab151559）（英国Abcam公司）；p-Tau Antibody（Thr205）：sc-101817（美国Santa Cruz Biotechnology公司）；β-Action Antibody（c4）：sc-47778（美国Santa Cruz Biotechnology公司）；DYY-7C型垂直板电泳转移装置（北京六一仪器厂）；TS-200型常温匀速摇床（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；SF-200型塑料封接机（江苏连云港微波电器厂）；LAS-3000型化学发光成像分析系统（日本FuJiFilm公司）；图像采集系统（日本Olympus公司）；海信冷藏冷冻冰箱BCD-301WT/A（海信集团有限公司）。

1.2病证结合大鼠模型的制备

1.2.1老年期痴呆大鼠模型的建立90只大鼠运用Rand函数选取其中60只（其余为正常组），对其进行双侧颈总动脉隔周结扎及切断术（2VO）：在术前禁食12h，用5%水合氯醛（7 mL/kg）麻醉，固定四肢、剪毛备皮、消毒处理，切开颈侧，分离一侧颈总动脉，上下两端双重结扎后，将中段颈动脉剪断，撒敷青霉素粉末，术后3d内再每天肌注青霉素以预防感染。1 w后以同样方法处置另一侧颈总动脉。2次手术共死亡22只大鼠。1 w后将剩余的38只手术大鼠以Rand函数随机分为老年期痴呆组（12只）、肾虚精亏证组（14只）、痰浊阻窍证组（12只），并开始连续腹腔注射D-gal［50mg/ （kg·d）］6 w。

1.2.2病证结合肾虚精亏证动物模型的构建肾虚精亏证实验大鼠在术后连续腹腔注射D-gal的基础上，每天下午5：00时将每只雄性大鼠与3只动情期雌性大鼠同笼，第2天早晨取出雄鼠，下午5：00时再按顺序投入另3只动情期雌性大鼠笼内，如此轮转，每天连续进行造模。同时，每天上午将模型大鼠放在直径24 cm，水深25 cm，水温30℃的塑料圆桶内行疲劳性游泳实验，每次30min，若发现有大鼠无力继续游动，即将下沉时则迅速将其捞出。连续造模6 w。

1.2.3病证结合痰浊阻窍证动物模型的构建痰浊阻窍证实验大鼠在术后连续腹腔注射D-gal的基础上，每日每笼5只大鼠固定投喂高脂乳剂［2］（10%猪油，10%吐温-80，10%丙二醇，0.5%丙基硫氧嘧啶，5%胆固醇，1%胆酸钠，63.5蒸馏水%）10 mL/ kg，连续4 w。

1.3各典型证候磷酸化位点的检测

行为学测试结束后，麻醉断头，在冰盒上取各组大鼠海马，对海马组织进行蛋白提取及蛋白定量。随后采用蛋白质免疫印迹法（Western Blot）检测各个典型证候的海马组织Tau蛋白在4个磷酸化位点上的表达，最后在影像分析仪系统内显影并扫描记录图像。

1.4统计学分析

实验得到的条带用GelPro 3.2软件进行灰度扫描和统计，对比各组目标条带之间的异同。其余数据采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验，P＜0.05认为具有统计学意义。

2结果

研究结果显示，在Tau蛋白脯氨酸富集区的磷酸化位点，与老年期痴呆证组相比，病证结合痰浊阻窍证组主要在205和231位磷酸化水平显著增强，肾虚精亏证组主要在181、205、231位磷酸化水平显著增强。结果见图1。

3讨论

图1　各组Tau蛋白磷酸化位点的变化

同病异证是一种在疾病背景下独立存在的病理生理整体反应状态，即指同一种病，可有不同的证候。如果说“异病同证”的概念主要是用于探索中医“证”的本质，那么，“同病异证”的概念则更多地是用来指导疾病的中西医结合临床治疗。提出“同病异证”的初衷，是强调中医辨证论治所体现的个体化特色。而现在西医的疾病诊断注重患者共同的病理基础，但对体质、年龄、性别、生活环境等带来的个体差异，则顾及不够；或即使有所认识，也缺乏有效的干预手段。而“同病异证”则能优化对个体间差异的认知和处理，以中医辨证论治的理论来归纳同一疾病患者的不同证型，并指导中医的治疗。通过辨病与辨证相结合，能兼顾患者群体的普遍性和特殊性。

基于以上理论，人们运用多种技术对“同病异证”开展了多方面的实验研究。有的研究者从体质因素出发，通过基因、蛋白水平等方面对“同病异证”的理论进行研究。而有的研究者从外界因素出发，通过代谢产物、相关生化产物及行为反应对此理论进行研究。蛋白质组学方法在中医证候学中也得到了广泛的应用和发展，因为它具有同中医“证”相似的动态、时间、空间、特异、整体等特性。笔者认为蛋白质与中医“气”具有相似的特质，中医的“气”通过气化决定人体的健康与疾病，而不同的蛋白质在体内聚集从而影响身体健康或疾病。

Tau蛋白是一种可磷酸化的蛋白，磷酸化修饰是其一种很重要的翻译后修饰。成人大脑里表达有6种不同亚型的Tau，最长的有441个氨基酸，其中包含有80个丝氨酸或苏氨酸残基以及5个酪氨酸残基，也就是讲，Tau蛋白的20%氨基酸都有可能发生磷酸化改变［3］。另外一些文献报道了在某些情况下Tau蛋白上酪氨酸（Tyr）也可以被磷酸化［4-5］。通过磷酸化依赖的单克隆抗体方法、质谱及其他测序技术等方法对老年期痴呆病人脑中Tau的磷酸化位点进行鉴定，目前已发现40个以上的磷酸化位点，而这些磷酸化位点仅少数存在于微管结合区。特异位点的磷酸化对Tau蛋白功能造成的影响是不同的，Tau不同位点的磷酸化功能有一定的差异，其中脯氨酸富集区的磷酸化位点发生磷酸化时，其功能为抑制Tau与微管结构的结合，抑制微管合成。许多文献已报道当262位、235位发生磷酸化时，可显著抑制微管合成能力，并且促进自身聚集。因此，Tau蛋白过度磷酸化应着重观察脯氨酸富集区的磷酸化位点的变化。

从我们现有的研究结果来看，各组模型Tau蛋白磷酸化水平明显增高，说明了Tau蛋白的代谢与老年期痴呆有明显的关联。两个不同证候在脯氨酸富集区磷酸化位点各有特色，提示我们在不同的证候模型中，Tau蛋白与微管的结合能力降低，Tau出现了特异性位点磷酸化。基于不同的磷酸化位点由不同的激酶所激活，提示我们不同的证候模型可激活不同的信号转导通路，其中181位磷酸化主要由GSK3β通过非卯靠式作用将磷酸根转移给181，而痰浊组181位未发生显著的磷酸化改变，提示我们在痰浊证候模型中，GSK3β非卯靠式作用并未发生作用。不同模型组出现了Tau蛋白特异性位点磷酸化改变，而不同位点磷酸化具有各自不同的上游信号通路，提示在不同证候模型会激活不同的信号通道介导发生Tau蛋白的磷酸化改变。

基于此实验研究的结果，我们论证了中医“同病异证”的现代科学内涵，证明了传统中医的科学性，从而更好地指导临床实践活动。

［1］龚成新，王建枝.Tau蛋白在老年性痴呆症神经原纤维退行性变中的作用［J］.医学分子生物学杂志，2006，3（3）：163-169.

［2］石鹤坤，张宏，杜青云，等.三种高脂乳剂诱导实验性大鼠高脂血症模型的比较［J］.中国比较医学杂志，2012（9）：55-57.

［3］Wang J Z，Xia Y Y，Grund K E，et al.Abnormal hyperphosphorylation of Tau sitesregulation and molecular mechanism of neurofibrillary degeneration［J］.Alzheimers Dis，2013（33）：123-139.

［4］Lee G，Thangavel R，Sharma V M，et al.Phosphorylation of Tau by Fyn：implications for Alzheimer′s disease［J］.Neuro，2004（24）：2 304-2 312.

［5］Lebouvier T，Scales T M.The microtubule associated protein Tau is phosphorylated by Syk［J］.Biochim Biophys Acta，2008（1 783）：188-192.

（编辑：翟春涛）

Reflect on Tau protein in proline-rich region of phosphorylation sites of two typical syndromes with senile dementia disease based on the same disease with different syndromes of Chinese medicine theory

Guo Bin，Guo Lei，Han Cheng，Shi Weibin
（Shanxi College of TCM，Taiyuan Shanxi 030024）

Objective：To observe Tau protein in proline-rich region of phosphorylation sites of two typical syndromes with senile dementia disease rat model and to analyze its specific phosphorylation of two syndromes，reflecting“the same disease with different syndromes”of Chinese medicine theory.Methods：Two carotid arteries were ligated one week apart，D-galactose was injected in intraperitoneal to establish Senile dementia rats model，subjected to fatigue of working and sexy stimuli and raise fat diet milk in the model on the basis of disease，then the corresponding rat model of senile dementia was established，which combined of disease and syndrome.Followed by Western blot method，to observed abnormal phosphorylation of Tau protein in the proline-rich region Thrl81，Thr205，Thr231，Ser262 phosphorylation sites.Result：In the Tau protein proline-rich region，compared with the Senile Dementia group，the disease with phlegm blocking orifices syndrome group significantly phosphorylation levels were increased at 205 and 231 sites，phosphorylation levels of the disease with kidney and essence deficiency syndrome group were significantly increased in 181，205，231 sites.Conclusion：All typical senile dementia syndromes have specific phosphorylation sites on Tau protein proline-rich region，revealing the scientific connotation of“the same disease with different syndrome”theory.

senile dementia；syndrome；comlined disease with syndrome；phosphorylation sites of Tau protein

R228

A

1671-0258（2016）03-0017-04

国家自然科学基金项目（81173165）

郭斌，在读硕士，E-mail：269553177@qq.com

郭蕾，教授，博士研究生导师，E-mail：glqzl123@163.com