金雀异黄素对围绝经期模型小鼠卵巢组织及其安全性的影响

张明玉，迟晓星，丁啸宇，钱丽丽

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆163319）

金雀异黄素对围绝经期模型小鼠卵巢组织及其安全性的影响

张明玉，迟晓星，丁啸宇，钱丽丽

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆163319）

通过建立围绝经期小鼠模型，观察金雀异黄素（Gen）对卵巢组织及安全性的影响。选用50只11～12月龄雌性ICR小鼠，按体重随机分为5组，即对照组、阳性对照组、高、中、低剂量组（15、30、60 mg·kg-1Gen灌胃）。采用ELISA法测小鼠卵巢组织中Bcl-2与Bax蛋白水平，对小鼠重要脏器进行病理组织学检查。结果显示小鼠体重及重要脏器无明显变化，高剂量组、阳性对照组Bax蛋白下降明显（P＜0.05）。揭示实验剂量下Gen对围绝经期小鼠重要脏器及体重无明显影响，可通过调节Bcl-2与Bax蛋白水平来保护卵巢细胞。

金雀异黄素；围绝经期模型小鼠；Bcl-2蛋白；Bax蛋白

围绝经期包括即将绝经前的时期和绝经后的第1年，其本质是卵巢功能动态衰退的过程，包括卵巢储备加速下降和生殖激素波动性变化，表现为月经模式改变、生育能力下降、绝经症状逐渐出现、发生各种慢性疾病的危险性逐渐上升［1-2］，卵巢功能减退引起的内分泌紊乱是导致围绝经期综合征发生的主要原因［3］。近年来围绝经期综合征有发病率上升、发病年龄提早的趋势，由于病程缠绵、反复发作，给广大围绝经期妇女的学习和工作造成了危害和痛苦，目前已成为影响妇女健康的严重问题。长期以来，国内外一直采用激素替代疗法治疗围绝经期综合征，虽然取得了一定疗效［4］，但由于可能导致某些妇科肿瘤的患病几率增加，甚至具有致癌的潜在危险，因此寻求更安全有效的雌激素替代药物，已成为当前围绝经期综合征防治工作的首要任务。

植物雌激素在人类饮食中主要体现在豆类及其制品中的异黄酮。金雀异黄素是大豆异黄酮中活性较强的主要成分，主要以游离型苷元和结合型糖苷的形式存在［5］。在富含豆肽的多种天然植物中含量较多，其抗氧化、类雌激素、抗肿瘤、影响骨代谢及心血管系统等作用已受到国内外的重视［6-7］。金雀异黄素分子结构与人体自身雌激素相同，能与雌激素受体结合，这种结合力虽然很低，活性只有内源雌激素的千分之一，但进入人体后可完全与雌激素受体结合，发挥雌激素的作用［8］，在生物体内可产生典型的雌激素反应［9］。对于不同组织，还可产生与雌激素相拮抗的作用，具有雌激素表达双向调节效应，至于表现为何种活性主要取决于其局部浓度、内源性雌激素含量以及组织器官的ERs水平［10］。除了研究金雀异黄素对围绝经期女性的有益作用之外，还要考虑其安全性问题，因此研究通过建立围绝经期小鼠模型，以金雀异黄素为受试物，观察金雀异黄素对小鼠体重、重要脏器、卵巢组织中Bcl-2蛋白和Bax蛋白的影响，探讨金雀异黄素对围绝经期小鼠的安全性。

1 材料与方法

1.1 材料

金雀异黄素：分子式C15H1005，分子量270.23，溶解性：溶于DMSO、甲醇，几乎不溶于水。上海融禾医药科技发展有限公司，纯度＞98%；戊酸雌二醇：拜耳医药保健有限公司，每片1 mg；羧甲基纤维素钠；酶标仪：澳大利亚TECAN公司；小鼠酶联免疫检测试剂盒：上海史瑞可科技有限公司。

1.2 试验动物与分组

雌性ICR小白鼠50只，11～12月龄［11］，体重35± 10 g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供（SPF级）。根据体重随机分组，把小白鼠分成5组，每组10只，分别为对照组、雌激素组、高剂量组、中剂量组、低剂量组。

1.3 围绝经期小鼠模型建立与试验设计

SAFD饲料配方：富含GEN和紫花苜蓿成分由玉米、小麦和酪蛋白代替，以突出处理因素（GEN）对实验结果的影响。

金雀异黄素不溶于水，用羧甲基纤维素钠助溶。对照组（Control group）：0.5%羧甲基纤维素钠灌胃；低剂量组（Low dose group）：Gen 15 mg·kg-1灌胃；中剂量组（Middle dose group）：Gen 30 mg·kg-1灌胃；高剂量组（High dose group）：Gen 60 mg·kg-1灌胃；阳性对照组（Positive control group）：戊酸雌二醇0.5 mg·kg-1灌胃。试验持续8周。

1.4 指标检测与方法

末次给药后，各组小鼠禁食12 h，不禁水，用电子天平称重后，断头取血，低速离心分离血清-20℃保存，迅速取出两侧卵巢，液氮冻存。ELISA试剂盒检测小鼠卵巢组织Bcl-2蛋白、Bax蛋白。用酶标仪（波长450 nm）测定吸光度，并通过标准曲线计算测定指标浓度。分别摘取肝脏、脾脏、肾脏、脑、卵巢、子宫称重。一部分样品固定，HE染色，切片。

1.5 统计与分析

应用SPASS19.0软件进行方差分析，对结果进行T检验统计学处理，P＜0.05为差异有显著性意义。

2 结果与分析

2.1 小鼠体重分析

表1 各组小鼠体重测定结果（±s，g）（n=10）Table 1 Results of each group of mice weight（x¯±s，g）（n=10）

表1 各组小鼠体重测定结果（±s，g）（n=10）Table 1 Results of each group of mice weight（x¯±s，g）（n=10）

注：*P＜0.05与对照组比较显著。

周数C-Gen P-Gen H-Gen M-Gen L-Gen 1周43.91±5.64 43.81±3.06 43.78±2.96 43.68±2.48 42.65±2.91 2周38.76±4.54 41.80±2.63 41.10±1.88 39.77±2.91 40.71±3.29 3周35.17±5.44 41.73±2.30 41.55±1.94 43.85±5.07 40.70±4.34 4周31.64±4.00 40.13±2.70 41.01±2.47 40.43±3.40 36.87±4.67 5周30.51±2.97 41.06±3.30 40.66±2.59 39.04±4.39 32.84±5.50 6周30.48±4.01 37.27±2.77 37.80±4.65 34.53±5.81 29.41±2.95 7周29.94±3.61 31.88±4.28 32.66±4.12 32.75±7.70 30.03±3.07 8周29.90±4.28 31.28±3.62 30.45±2.01 32.58±6.71 30.15±4.30*

表1结果显示各组小鼠体重生长趋势无明显差异，生长状态良好，说明金雀异黄素对小鼠体重无明显影响。

2.2 小鼠内脏/体比结果

表2结果表明，与对照组比较高剂量组小鼠卵巢/体比降低，差异显著（P＜0.05）与阳性对照组作用相似。

表2 各组小鼠内脏/体比测定结果（x¯±s）（n=10）Table 2 Results of mice viscera/body ratio measurement（x¯±s）（n=10）

2.3 小鼠主要脏器病理检查结果

图1～图3对小鼠卵巢、脑和肝脏组织进行病理组织学检查，可以看出各组小鼠的肝脏和脑的病理组织学检查都没有明显的病理改变。阳性对照组小鼠卵巢发生了明显的病理学改变，腺体数量增多，细胞呈高柱状，内膜上皮细胞数量增多，增生明显，间质疏松。高剂量组小鼠卵巢腺体数量轻度增多，但不明显，内膜上皮细胞排列基本正常，偶尔可见细胞高度不一，间质无明显变化。由此可见，在当前剂量下，金雀异黄素对围绝经期小鼠的重要脏器无明显影响。

图1 小鼠卵巢腺体组织病理学检查（A.CG；B.PG C.H-Gen，40×）Fig.1 Histopathological examination of mouse ovary glandular tissue

图2 小鼠脑组织病理学检查（A.CG；B.PG；C.H-Gen，40×）Fig.2 Histopathological examination of mouse brain tissue

图3 小鼠肝脏组织病理学检查（A.CG；B.PG；C.H-Gen，40×）Fig.3 Histopathological examination of mouse liver tissue

2.4 小鼠Bcl-2蛋白、Bax蛋白检测结果

表3可知，中、高剂量GEN可升高小鼠卵巢组织中Bcl-2蛋白水平，但差异无统计学意义，（P＞0.05）；各剂量组小鼠卵巢组织中Bax蛋白水平呈下降趋势，其中高剂量组和雌激素组下降明显，与对照组相比差异显著（P＜0.05），说明金雀异黄素可通过调节促细胞凋亡蛋白和抗细胞凋亡蛋白的水平来保护卵巢细胞功能。

表3 各组小鼠卵巢组织Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达结果（x¯±s，n=10）（pg·m L-1）Table 3 Expression results of mice ovarian tissue in each group of Bcl-2 and Bax protein（x¯±s，n=10）（pg·mL-1）

3 讨论

（1）金雀异黄素作为一种存在于大豆异黄酮中的活性成分而具有许多生物学活性，包括能够与雌激素受体结合的弱的雌激素样作用及在药理作用下能够抑制蛋白酪氨酸激酶的作用，也被称为植物雌激素［12］。围绝经综合征主要是由于卵巢老化，雌激素分泌减少而引起的。实验以11～12月龄雌性ICR小鼠模拟女性围绝经期阶段，以不同浓度的金雀异黄素对围绝经期小鼠灌胃，通过金雀异黄素对小鼠体重、重要脏器、卵巢组织中Bcl-2蛋白和Bax蛋白的影响作为研究，探讨金雀异黄素对围绝经期小鼠的安全性。灌胃期间小鼠体重变化及主要脏器病理检查无异常变化，证明金雀异黄素在实验剂量下对小鼠的正常生长无异常影响，与雌激素对围绝经期小鼠卵巢的副作用相比，在当前剂量下，不会影响小鼠体重及重要脏器功能，对小鼠是安全的。

（2）作为许多化学作用靶器官之一的卵巢，其细胞结构和功能状态与女性性腺和生殖功能密切相关。围绝经期的本质是卵巢功能动态衰退的过程。Bcl-2蛋白抑制一切生物体细胞凋亡过程，它可以在正常细胞激活和发展中表达，也能在成熟组织中表达，但在凋亡细胞中表达量很低甚至无表达。Bcl-2在卵巢细胞凋亡调控过程中发挥重要的作用［13］。Bax蛋白是Bcl-2蛋白的同系物，在器官和组织中的分布要比Bcl-2蛋白广泛，其促进细胞凋亡的机理可能与抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白有关，后者会促使Bax蛋白失去促蛋白凋亡的作用［14］。多项资料表明［15-17］，Bcl-2和Bax是细胞凋亡调控机制中两个非常重要的因子，当Bcl-2大量表达时，形成Bcl-2同源二聚体，细胞受到保护；当Bax大量表达时，形成Bax同源二聚体，细胞趋向凋亡。实验以金雀异黄素为试受药物，通过检测卵巢组织中Bcl-2和Bax含量以达到对围绝经期小鼠安全性的研究。研究结果表明，高剂量GEN（60 mg·kg-1）可明显降低促凋亡基因Bax在围绝经期小鼠卵巢组织中的表达，效果与雌激素相似，提示金雀异黄素对卵巢功能的保护作用可能与抑制Bax蛋白表达，从而抑制卵巢细胞凋亡有关。

（3）金雀异黄素是来源于植物并有与雌激素相似结构的植物雌激素，其雌激素的调节作用引起广泛关注。目前植物雌激素作为激素替代药物、抗癌药物以及食品添加物和补充物应用［18］。在研究金雀异黄素与人类健康的关系时，从细胞分子水平、动物模型到人体实验、大规模流行病学调查的结果存在较大的争议，实验室中金雀异黄素用量通常远高于食物中的含量，且使用的种类、纯度、用量、采用的细胞系以及其他实验条件等均不尽相同，缺乏统一的评价标准，给金雀异黄素的研究工作和广泛应用带来一定的困难。随着对金雀异黄素功能性和营养性的深入研究，其提取及精制工艺的不断完善，金雀异黄素将会在医药、保健品、食品、饮料及其他行业得到越来越广泛的应用［19］。

［1］刘云嵘，葛秦生.九十年代绝经研究［M］.北京：人民卫生出版社，1998.

［2］曹泽毅.中华妇产科学［M］.2版.北京：人民卫生出版社，2006.

［3］杨敏，李灿东，李红，等.围绝经期综合征中医证素与性激素水平的相关研究［J］.中华中医药杂志，2012，27（2）：366-368.

［4］杜丹，魏洁玲，陈妙云.六味地黄丸联合激素替代治疗卵巢早衰的临床研究［J］.中华中医药学刊，2013，31（12）：2738-4000.

［5］迟晓星，张明玉，张涛，等.金雀异黄素对多卵囊巢综综合征大鼠卵巢组织中Bcl-2及Bax mRNA表达的影响［J］.动物营养学报，2014，26（4）：1120-1126.

［6］郑高利.大豆异黄酮的药理作用I［J］.中国现代应用药学，1998，15（1）：4-5.

［7］郑高利.大豆异黄酮的药理作用II［J］.中国现代应用药学，1998，15（2）：9-11.

［8］迟晓星，张涛，陈容，等.金雀异黄素对实验性雌性大鼠高雄激素血症的治疗作用［J］.营养学报，2013，35（1）：68-72.

［9］周素梅.食物中的植物化学成分及功能性［J］.食品与机械，1999（1）：13-14.

［10］Wagner J D，Anthony M S，Cline J M.Soy phtoestmgens：research on benefits and risks［J］.Clin Obstet Gynecol，2001，44（4）：843-852.

［11］傅萍，赵宏利，姜萍，等.自然衰老ICR小鼠进入围绝经期时限的研究［J］.中华中医药学刊，2008，26（5）：974-975.

［12］迟晓星，陈容，张丽媛.金雀异黄素对青年雌性大鼠血清性激素水的影响［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2013，25（2）：36-38.

［13］Sasson R，Amsterdam A.Stimulation of apoptosis in human granulosa cells from in vitro fertilization patients and its prevention by dexamethasone：involvement of cell contact and bcl-2 expression［J］.Clin Endocrinol Metab，2002，87（7）：3441-3451.

［14］刘秋晨，单春乔，刘艳.L-阿拉伯糖缓解便秘作用的实验研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2014，26（2）：50-52.

［15］Vickers S，Coman R G，Human R M，et al.Expression and activity of the Fas antigen in bovine ovarian follicle cells［J］.Biology Reprod，2000，62（5）：54-61.

［16］Porter D A，Harman R M，Cowan R G.Relationship of Fas ligand expression and atresia during bovine follicle development［J］.Reproducing，2001，121（4）：561-569.

［17］Kogiso M，Sakai K.Genistein suppresses antigen-specific competition with 17beta-estradiol receptors for estrogen in ovalbumin-immunized BALB/c mice［J］.Nutrition，2006，22（7-8）：802-809.

［18］Naciff J M，Jump M L，Torontali S M，et al.Gene expreasion profile induced by 17alpha ethynyl eatradiol，bispheno-IA，and genistein in the developing female reproductive system of the rat［J］.Toxicol，2002，68（1）：184-199.

［19］许银燕，管静.Genistein的生物学功能研究进展［J］.医学综述，2010，16（5）：735-737.

Safety of Genistein Acting on Ovaries of M enopausal M odel M ice

Zhang M ingyu，Chi Xiaoxing，Ding Xiaoyu，Qian Lili
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

According to set up the perimenopausal mice model and observed the impact on ovarian tissue and security，50 female 11～12 months-old ICR mice were chosen to be divided into five groups by weight，each group was control group，positive dose group of high，middle and low dose group（Gen concentration 15，30，60 mg·kg-1），respectively.The levels of Bcl-2 and Bax protein in mice’ovarian tissues were detected by ELISA，and the histopathologic examination of vital organs was carried.The results showed that there was no obvious change in mice weight and vital organs.The level of Bax protein decreased in high dose group and positive dose group，which had a significant difference（P＜0.05）.The revealing Gen had no obvious effects on menopausal transition model mice of important organs and weight，and it could protected the ovarian cells by adjusting Bcl-2 and Bax protein levels.

genistein；perimenopause mouse model；Bcl-2 protein；Bax protein

Q78

A

1002-2090（2016）03-0051-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.03.011

2015-03-10

农业部农产加工品质量监督检验测试中心（大庆）工作站博士后资助课题（LRB13-153）。

张明玉（1990-），女，黑龙江八一农垦大学食品学院2013级硕士研究生。

迟晓星，女，教授，硕士研究生导师，E-mail：chixiaoxing@sina.com。