添加乳酸菌和糖蜜对秸秆生物饲料的发酵品质及In vitro干物质消失率和瘤胃甲烷生成的影响

周亚强，韩雅惠，蒋再慧，马衍旋，石少磊，孙瑞涛，李悦，韩华，唐德江，侯建军，曹阳

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆163319；2.黑龙江中升牧业有限公司）

添加乳酸菌和糖蜜对秸秆生物饲料的发酵品质及In vitro干物质消失率和瘤胃甲烷生成的影响

周亚强1，韩雅惠1，蒋再慧1，马衍旋1，石少磊1，孙瑞涛1，李悦1，韩华1，唐德江1，侯建军2，曹阳1

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆163319；2.黑龙江中升牧业有限公司）

采用小规模发酵法，试验处理包括无添加组（对照组）、乳酸菌、糖蜜以及乳酸菌和糖蜜共同添加组。30 d后开封，乳酸菌和糖蜜添加组感官评分良好；乳酸菌、乳酸菌和糖蜜混合添加组的pH低于（P＜0.05）对照组和糖蜜添加组。4个处理组的乳酸菌数量均在106～107（cfu·g-1）以上，3个添加组未检出酪酸菌和大肠杆菌，而酵母菌、耐热菌数量分别为102～106和103（cfu·g-1）；对照组中大肠杆菌和酵母菌均为106（cfu·g-1）。糖蜜、乳酸菌以及二者共同添加组的In vitro干物质消失率显著高于对照组，而只有乳酸菌添加组的瘤胃甲烷生成量低于对照组。由此可见，添加乳酸菌、糖蜜以及二者混合添加均有助于秸秆发酵，抑制有害细菌的生长，能够得到高品质的玉米秸秆生物发酵饲料，并且添加乳酸菌可以降低秸秆生物饲料的In vitro瘤胃甲烷生成量。

乳酸菌；糖蜜；风干玉米秸秆；发酵品质；甲烷

中国是农业大国，玉米作为主要种植的农作物，其副产物玉米秸秆资源更为丰富，年产量约2亿t［1］。玉米秸秆是有着巨大潜力而尚未被充分开发利用的饲料资源［2］，玉米秸秆中含有丰富的营养成分，是反刍动物粗饲料的主要原料之一。但是，就我国目前的情况来说，被用作饲料的玉米秸秆却很少。这主要是因为玉米秸秆中粗蛋白（CP）含量较低，中性洗涤纤维（NDF）含量较高，而使其适口性较差［3］。正常情况下，一般要求反刍动物饲料CP含量不低于8%［3］，而玉米秸秆中CP含量低于8%，且消化率低，导致瘤胃内没有足够的氮源［4］，最终影响到瘤胃微生物的增殖和发酵［5］。因此，为了克服这些限制玉米秸秆作为饲料利用的因素，提高其利用价值，我们需要对玉米秸秆进行物理、化学和生物学处理，以改善玉米秸秆品质，解决其存在的消化能低、适口性差以及粗蛋白含量低的问题［6］，从而研发出适合我国反刍动物养殖业使用的优质粗饲料。同时也能更好的利用这个丰富而廉价的资源，解决我国反刍动物粗饲料利用率低的难题。

然而，当饲料进入瘤胃后，瘤胃中微生物发酵饲料中非纤维性碳水化合物和植物纤维，产生可吸收利用的挥发性脂肪酸（VFA）的同时，瘤胃内产甲烷菌生成大量的甲烷［7］。瘤胃内饲料总能量的12%左右以甲烷的形式损失掉的同时，甲烷作为温室气体也极大地加剧全球变暖［8］。全球每年甲烷的排放量约为525 Tg，其中反刍动物甲烷的排放量约为85 Tg［8］。大量的反刍动物不仅需要提供庞大数量的饲料，而且排放甲烷量也急剧上升。因此，利用秸秆调制发酵生物饲料，在扩大饲料来源，节约饲料成本，减少资源的浪费，降低空气污染，同时也能减少瘤胃甲烷的排放，对减缓地球变暖具有重要意义。

研究通过添加糖蜜和乳酸菌，对风干玉米秸秆进行小规模发酵处理，常温贮存30 d后开封，感官评定发酵玉米秸秆的物理性状，分析水分，pH以及微生物组成及数量，探讨玉米秸秆发酵饲料调制的可行性技术，提高丰富而廉价的玉米秸秆资源的利用率。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验所用风干玉米秸秆来源于黑龙江八一农垦大学农学院实验田；糖蜜采购自济南市历城区圣茂化工有限公司；乳酸菌制剂（LAB，Lactobacillus plantarum，购自日本雪印公司）。

1.2 玉米秸秆的发酵及处理

采用单因素试验设计，试验处理包括无添加组、乳酸菌（LAB）、糖蜜（Molasses）以及乳酸菌和糖蜜共同（LAB+M）添加组。将收获籽粒后的风干玉米秸秆粉碎至1～2 cm，菌液按照每公斤饲料1 mL添加，糖蜜的添加量为4%。添加蒸馏水调整水分为60%并混合均匀。发酵用塑料袋尺寸为16×25 cm，每个处理3袋，每袋200 g，使用真空密封机（AT-620，北京吉奥德，北京），真空密封包装室温贮存30 d后开封，测定各项指标。

1.3 菌种准备

将乳酸菌制剂用灭菌水溶解，每毫升菌液中含活乳酸菌数不少于1.0×105cfu（Colony-Forming U－nits），4℃冰箱保存备用。

1.4 培养基

预先配制足够的固体培养基，包括培养乳酸菌（MRS，de man，rogosa，sharpe agar）、大肠杆菌（BLU，blue light broth agar）、酵母菌和霉菌（PDA，potato dextrose agar）、好氧菌和奶热菌（NA，nutrient agar）、酪酸菌（CLO，clostridial agar）的培养基，以上培养基均购自青岛海博生物有限公司。

1.5 pH测定方法

开封后，立即从4种发酵玉米秸秆样品中分别取20 g，放入聚乙烯袋内，再加入180 mL蒸馏水，随后，用均质器拍打90 s，再用定性滤纸进行过滤，收集滤液，同时测定滤液的pH［6］。

1.6 发酵玉米秸秆物理性状的感官评定

根据青贮质量评定标准［7］的说明，主要从质地、气味、色泽和有无霉变这4个方面进行感官评定。

1.7 微生物培养与细菌形态及计数

试验分别对4种处理的发酵玉米秸秆样品中所含有的乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌、霉菌、好氧菌、耐热细菌和酪酸菌进行培养与计数。首先，制作足够数量的MRS、BLU、NA、DRCA、PDA（需加入20%酒石酸）的固体培养基备用。按照Cao等所述的方法［9］，将4种处理的发酵玉米秸秆样品待测菌液的原菌液依次进行梯度稀释，分别稀释为10倍液、30倍液及50倍液，大肠杆菌、好氧菌和耐热细菌、酵母菌和霉菌分别在BLU、NA、PDA培养基上30℃恒温培养48 h；乳酸菌、酪酸菌分别在MRS、CLO培养基上30℃恒温厌氧培养48 h。最后，观察平板上长出的菌落，依依进行区分并计数（单位质量新鲜样品中微生物数量cfu·g-1）［9］。

1.8 In vitro体外培养

1.8.1 人工唾液

1.8.2 瘤胃液的收集

3头安装永久性瘤胃瘘管的绵羊提供瘤胃液。上午采食2 h后，通过4头绵羊的瘤胃瘘管进行采集瘤胃液，采集的瘤胃液用4层纱布过滤后，等体积混合，并通入CO2保持厌氧环境。

1.8.3 培养液的制备

人工唾液和瘤胃液以体积比4∶1的比例混合后，通入CO2，并置于39度水浴锅中备用。

1.8.4 生物饲料培养

称取粉碎（2 mm）的风干样品1 g，分别置于体积为128 mL的培养瓶中，称取50 mL的培养液注入培养瓶内，通入氮气保持厌氧环境，立即盖上胶盖，并用专用封口钳子压紧铝盖，将培养瓶置于恒温震荡水浴锅内，39度震荡培养48 h。

1.8.5 干物质消失率、pH及甲烷测定

心一横，跳下去，也就真一了百了了，这所有的艰难，这所有的要强和挣扎，就都不用了。那多舒坦呀，那多舒坦呀！那不就像睡在温暖的房子里，躺在柔软的床上吗？

根据Cao Y［10］的方法，分别对培养后样品的干物质消失率、培养液的pH以及甲烷进行了测定。

1.9 数据处理

试验采用SAS9.0软件对4组秸秆生物发酵饲料水分、pH、in vitro干物质消失率和瘤胃甲烷生成量的数据进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 感官评定

各组玉米秸秆经30 d发酵处理，其中无添加处理的玉米秸秆颜色为褐黄色、松软不粘手、有酒酸味，无发霉现象。经其他3种处理的玉米秸秆质地柔软、疏松稍湿润，松软不粘手，无发霉现象，颜色为黄色，有淡酸味。结果见表1。根据玉米秸秆青贮感官评价标准，得出各处理的感官评分均在51分以上（总分100分）。属于良好的黄贮玉米秸秆。

表1 不同处理的秸秆生物发酵饲料的感官评分Table 1 Sensory score of corn stover silage treated by M or LAB

2.2 秸秆生物发酵的水分与pH

玉米秸秆经过无添加、M、LAB、M+LAB 4种处理后的水分和pH见表2。4种处理水分含量关系为LAB>无添加>M>M+LAB，各处理间差异不显著（P> 0.05）。经过LAB、M+LAB处理后的pH显著（P＜0.05）低于糖蜜处理组。

2.3 秸秆生物发酵饲料的微生物组成及数量

发酵玉米秸秆饲料中微生物组成及数量见表3。乳酸菌在4个处理组中的数量为106～107（cfu·g-1）；大肠杆菌仅在无添加组检测出106（cfu·g-1）；好氧菌在4个试验处理组中的数量为106～107（cfu·g-1）；耐热细菌在添加组和对照组中的数量分别为103和105（cfu·g-1）；酵母菌在和M添加组中的数量为106（cfu·g-1），而在LAB和M+LAB添加组中为102（cfu·g-1）；在添加组和对照组均没有发现酪酸菌和霉菌。

表2 不同处理的秸秆生物发酵饲料的水分及pHTable 2 Moisture and pH of corn stover silage treated by M or LAB

表3 不同处理的发酵玉米秸秆的微生物组成及数量（cfu·g-1）Table 3 Microbial counts of corn stover silage treated by M or LAB

2.4 In vitro干物质消失率和瘤胃甲烷生成量

不同处理对秸秆饲料体外培养干物质消失率和甲烷生成量的影响见表4。糖蜜、乳酸菌以及二者共同添加组的干物质消失率显著高于无添加组（P＜0.05），而乳酸菌添加组的甲烷生成量显著低于无添加组和糖蜜添加组（P＜0.05）。

表4 不同处理秸秆生物发酵饲料的干物质消失率及甲烷生成量Table 4 In vitro dry matter digestibility and methane production of corn stover silage treated by M or LAB

3 讨论

试验从水分、pH、色泽、气味、质地等方面分别对无添加、M、LAB、M+LAB 4种处理的发酵玉米秸秆进行感官评定。经30 d发酵后，无添加处理的玉米秸秆颜色为褐黄色、质地松软不粘手、有淡酸味，无发霉现象；经其他三种处理的玉米秸秆质地疏松稍湿润、不粘手，无发霉现象，颜色为黄色，有醇香味。各处理的感官评分均在51分以上，属于良好的黄贮玉米秸秆。但是，试验为黄贮玉米秸秆，而感官评定中参考的是玉米秸秆青贮感官评价标准，所以水分含量比青贮玉米水分含量稍低。其中，LAB和M+LAB处理的玉米秸秆感官评分最高，而M的处理评分次之，这说明LAB处理对发酵玉米秸秆的发酵品质有益。

青贮秸秆的发酵品质主要由pH值和有机酸含量（乳酸、乙酸、丙酸、丁酸）等决定。pH是评价青贮饲料品质最简单且最直观的指标之一，pH越低，有机酸含量越高，青贮越容易保存［11］。玉米秸秆发酵时，水分越高，发酵品质越差，试验中各个处理的水分都在60%左右，故发酵效果较好。同时，pH的高低也是判断风干玉米秸秆青贮是否成功的重要指标，当青贮玉米秸秆的pH在4.0以下时，青贮质量为优等；当pH在4.1～4.3时，青贮质量较为良好；当pH在4.4～5.0时，青贮质量较为一般；而当pH在5.0以上时，青贮质量则为劣等［12］。由此可见，试验中无添加组黄贮玉米秸秆质量较为一般，LAB、M+LAB处理组的pH显著下降，发酵质量较好，发酵玉米秸秆青贮中的有害微生物处于被抑制状态。

玉米秸秆黄贮中，乳酸菌是具有重要作用的益生菌，其种类和数量对发酵玉米秸秆品质有很大影响［13］；酵母菌能够提高奶牛干物质采食量，产奶量以及消化粗蛋白和酸性洗涤纤维的能力［14］；而霉菌是饲料中的有害菌，不仅会造成饲料中营养物质的损失，还会危害家畜和人的健康［15］。一般情况下，发酵品质良好的饲料，由于pH较低，会抑制微生物包括乳酸菌的活性［16］。

试验中，4种发酵饲料的乳酸菌均在106～107之间，说明试验所用的玉米秸秆附着一定数目的乳酸菌，并且由于乳酸菌的耐酸性较强，在密封发酵的过程中能够进行繁殖［9］。添加高效产酸LAB后，发酵饲料中可溶性糖生成乳酸，降低pH，抑制了酵母菌活性，大肠杆菌和霉菌被完全抑制。所以，在LAB添加组中，乳酸菌有轻微的减少，而酵母菌明显减少，这与以前对发酵稻草的研究［10］结果相似。

饲料在发酵过程中，乳酸菌利用原料中的可溶性糖生成乳酸，降低pH，抑制有害微生物，减少养分损失［17］。改变了碳水化合物的组成和降解特性，而碳水化合物的组成和降解特性在很大程度上决定了瘤胃内甲烷的生成量［18］。根据甲烷生成量的预测模型：甲烷生成量（g·d-1）=91+50×可消化纤维素（kg·d-1）+ 40×可消化半纤维素（kg·d-1）+24×可消化淀粉（kg·d-1）+ 67×可消化糖（kg·d-1）（R2=0.84）［18］。通常发酵饲料中的乳酸菌和其他菌类很容易发酵分解糖分、淀粉及一部分纤维素，转变为菌体蛋白等并生成有机酸［17］，降低了饲料中一部分碳水化合物，即改变了碳水化合物组成，并且发酵生成的有机酸可以直接被瘤胃或微生物吸收利用，使他们不参与瘤胃内发酵，可能导致甲烷生成量减少［17］。

试验中，尽管糖蜜和乳酸菌共同添加可以促进秸秆生物饲料乳酸发酵，降低pH，减少养分损失，进而提高干物质消失率。但由于添加糖蜜增加了饲料中的可消化糖分，便导致瘤胃甲烷生成量的增加。如上所述，乳酸菌添加后，可以分解秸秆中可溶性糖生成乳酸，减少了甲烷生成量等式中的可消化糖的含量，进而降低瘤胃甲烷的生成。

4 结论

添加乳酸菌以及LAB+M可以降低pH，抑制有害微生物的生长，减少饲料养分损失，促进玉米秸秆生物饲料发酵。同时添加乳酸菌也可以提高体外培养干物质消失率，减少瘤胃甲烷生成。

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Effects of Adding Lactic Acid Bacteria and M olasses on Fermentation Characteristics and in Vitro Rum inal M ethane Production of Corn Stover Silage

Zhou Yaqiang1，Han Yahui1，Jiang Zaihui1，Ma Yanxuan1，Shi Shaolei1，Sun Ruitao1，Li Yue1，Han Hua1，Tang Dejiang1，Hou Jianjun2，Cao Yang1
（1.College of Animal science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Heilongjiang Zhongsheng Husbandry Co.Ltd.）

A small-scale fermentation system was used and treatments were designed as control group without additive and experimental group with molasses（M），lactic acid bacteria（LAB），and M+LAB.The silos were stored at room temperature for 30 days of fermentation，and sensory evaluation，pH and counts of viable microorganisms were determined.The silages treated by M，LAB and M+LAB have high sensory score，and 106～107（cfu·g-1）LAB，no clostridia or coliform bacteria，and 103（cfu·g-1）bacilli and 102～106（cfu·g-1）yeasts.But the control silage had 107（cfu·g-1）LAB，106（cfu/g）coliform bacteria or yeasts.There was no difference for the moisture content among the four groups of silage.The values of pH for LAB and M+LAB silage were significantly lower（P＜0.05）than that for the control silage or M silage.The results showed that adding LAB，M and M+LAB inhibited the growth of the bad bacteria and improved the fermentation quality of the silage with dry corn stover，and got a good quality fermented feed，and the addition of LAB could decrease in vitro ruminal methane of the silage of dry corn stover.

Lactic acid bacteria；molasses；dry corn stover；fermentation quality；methane

S816.7

A

1002-2090（2016）03-0046-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.03.010

2015-06-26

黑龙江省大学生创新创业训练计划项目（20141022318）。

周亚强（1989-），男，黑龙江八一农垦大学动物科技学院2011级动物科学专业本科生。

曹阳，教授，E-mail：hbdkcaoyang@136.com。