非洲菊离体保存技术概述及展望

张志刚

摘要：介绍非洲菊常温离体保存、低温离体保存、超低温离体保存方法的原理、种类、特点、效果及研究进展，展望相关技术的研究前景，为非洲菊种质资源保存及其在辽宁地区的栽培提供参考。

关键词：离体保存；非洲菊；常温；低温；超低温

中图分类号：S682.1+1 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2016）03-0001-02

非洲菊（Gerbera jamesonii）别名扶郎花、灯盏花，是菊科非洲菊属多年生宿根常绿草本，主产于南非，少数分布在亚洲。其花大，色彩丰富，花枝挺拔，具有很高的观赏价值；在适宜的条件下能够周年开花，产花量高，切花的瓶插寿命长，具有较高的经济价值。目前，非洲菊已成为世界五大切花之一。

1 非洲菊常温离体保存方法

1.1 一般保存

该方法被广泛采用。采用此方式虽然可以随时进行繁殖，但需要不断的继代培养，浪费人力物力，占用空间大，管理费用高，且容易造成材料污染、混淆甚至丢失，易导致自然变异和种质退化。

1.2 降低培养基内的营养水平

通过改变培养基中的物质浓度和种类，达到培养物保持最低生长水平的目的。与MS及1/4MS等几种培养基相比，无菌水保存菠萝试管苗的效果更好，保存1 a后81%的植株仍有活力。用无菌水保存菠萝试管苗，在不加任何生长素和细胞分裂素、只加入5.0 mg/L根皮苷的MS培养基上，常温下短果杜鹃种质可保存40个月，解除保存后试管苗恢复生长快，且苗粗壮生长旺盛，形态结构未出现异常。香青兰试管苗在1/4MS培养基中保存，前期存活率较低，但保存时间延长4个月以上。

1.3 在培养基中添加生长调节剂

在培养基中适当添加一些生长延缓剂，可延缓或抑制植株细胞生长。最常用的生长抑制剂有多效唑（PP333）、丁酰井（B9）、脱落酸（ABA）和矮壮素（CCC）等。唐凤鸾等用多效唑和矮壮素对保存黄花蒿组培苗时发现，在未加延缓剂的MS培养基上，材料生长快、节间长、植株高、茎上部很快在瓶内卷曲成团，60 d后植株老化变黄逐渐枯死，到90 d时已无植株存活。而经延缓剂处理的试管苗生长速度明显减慢，植株较矮，节间短，茎增粗，叶色浓绿。可见延缓剂可降低黄花蒿试管苗的生长速度，减少营养消耗，从而延长保存时间。洪森荣等以香果树试管苗的带芽茎段为离体保存材料，发现B9，ABA，CCC三种植物生长抑制剂均随着浓度的增加而使香果树带芽茎段的成活率提高，但达到一定浓度后成活率下降。

1.4 提高培养基的渗透压

通过提高培养基的渗透压抑制培养材料生长，可达到保存种质的目的。最常用的方法是在培养基中加入渗透性化合物，如蔗糖、甘露醇、山梨醇等。这些渗透性化合物能提高培养基的渗透势负值，造成水分逆境，从而降低细胞生长扩大所必需的膨压，使细胞吸水困难，减弱其新陈代谢，延缓细胞生长。同时，细胞壁酶的活性受到抑制，生长受阻，减少养分水分的消耗。虽然保存不同培养材料所需要的渗透物质含量不同，但试管苗存活率、保存时间、恢复生长率受培养基中高渗物质含量影响的变化趋势基本一致，均呈抛物线型。

一般来说，在保存初期这类化合物对试管苗存活率的影响不大，随着保存时间的延长，对减缓培养材料生长、延长保存时间的作用愈加明显。史永忠等认为在培养基中添加甘露醇，可延长苹果试管苗的保存期，提高其成活率。叶秀仙等以文心兰丛生芽为离体保存材料，研究限制生长法离体保存文心兰种质的适宜条件，结果表明，在常温条件下培养基中添加30 mg/L甘露醇，可有效延长文心兰试管苗继代间隔时间，保存180 d后存活率达l%。傅伊倩等得出结论：含有高浓度蔗糖和甘露醇的培养基可以使百合品种大花卷丹的试管苗保存1 a以上。岳新丽等的研究表明，20 mg/L山梨醇对马铃薯试管苗的保存具有明显抑制作用，可显著提高马铃薯试管苗成活率。

1.5 降低培养环境中的氧气浓度

通过降低培养基中氧分压来减慢培养材料的生长速度，从而保存植物组织培养材料的想法最早是由Caplin（1959）提出的，他在离体保存的胡萝卜根次生韧皮部上覆盖一层厚达38 mm的重石油，8个月后盖有重石油的材料生长很少，且培养基未见减少，仍可见鲜绿色，相反未覆盖矿物油的材料变成褐色，且培养基接近干涸。Gillis和Dengh在23 ℃的常温条件下，以欧洲甜樱桃的嫩芽为试材，浸没在石蜡中离体保存6个月后，也得到了相似的结果。

1.6 胶囊化或脱水处理

胶囊化是指在种质保存过程中用海藻酸胶或吉兰糖胶将保存材料包埋形成胶囊的过程。脱水则是利用硅胶或空气层流橱无菌空气流对种质进行干燥或者是将种质保存在含有高浓度蔗糖的培养基中。Nitzsphe于1980年首次报道了将脱水干燥法应用于组培材料中来保存植物种质资源中期的方法。随着人工种子研究的逐渐发展，该法开始备受重视，并初步在一些物种上实现了3个月到1 a的保存期。

1.7 复合限制生长措施

很多试验同时采用几种限制生长方法来实现种质的离体保存。兰芹英等对蒙自凤仙花茎尖进行了离体保存的研究，结果表明：最适保存条件为12 ℃，甘露醇含量为3%，保存1 a后存活率仍为100%；存活的幼苗及茎尖接种于增殖培养基，仍能正常生长、增殖和生根。

洪森荣等研究了PP333对野葛常温和低温保存的影响，得出的结论为：浓度为5 mg/L的PP333结合4 ℃低温可以提高试管苗的成活率，最适合野葛离体保存。叶景丰以西伯利亚花楸幼嫩茎段为外植体，研究结果表明：试管苗在2±2 ℃的冰箱冷藏室，可有效保存240 d以上，在含有琼脂7 mg/L和蔗糖50 mg/L的MS培养基上，试管苗的生长得到明显抑制。

2 非洲菊低温离体保存方法

缓慢生长保存最常用的方法是降低培养温度，现已广泛应用到研究中。猕猴桃、梨、苹果、草莓和属于无性繁殖蔬菜的芋头、马铃薯等作物，均可通过降低培养温度得到最佳保存效果。正确选择低温是延长保存时间和提高保存效果的关键，不同植物及同一种植物不同基因型对低温的敏感性是不同的。张玉芹等较系统地研究低温保存百合试管苗的技术，以鳞片为外植体组织培养并对其试管苗保存，研究结果表明：在常温条件下，培养基中无论添加ABA还是MNT，每3个月就要继代1次保存百合试管苗，而在1～5 ℃的低温条件下保存18个月后，大部分百合试管苗生长正常。

3 非洲菊超低温离体保存方法

超低温冷冻保存的冷源一般为深冷冰箱、干冰（-79 ℃）、液态氮及液氮蒸汽相，保存温度维持在-196 ℃。在这样的低温下，植物材料的新陈代谢和生长活动基本停止，处于生机“停顿”状态，很可能极大地延长保存材料寿命，且有效保持材料的遗传稳定性，从而安全长期的保存一些珍贵稀有种质。刘燕等曾对18个科47个种花卉种子（包括顽拗性种子和正常性种子）进行超低温保存，认为目前梅花花粉长期保存的最佳方法是液氮保存。Vida等以栗子茎尖为保存材料，研究了超低温保存过程中的影响因素，建立了有效的超低温保存程序。Tsai等研究了木瓜的超低温保存技术，建立了高效的超低温保存的玻璃化程序。

超低温保存法主要包括简化控速超低温保存法（慢速降温法、两步降温法、逐级降温法）、干燥法、预培养法、预培养干燥法、包埋干燥法、玻璃化法和包埋玻璃化法等。

4 结语

非洲菊品种杂合性高，种子实生繁殖的后代易发生变异。采用离体保存技术可以有效地克服组培生产中存在的问题，打破季节生长界限，有效节约空间，方便交通运输。但是目前关于非洲菊离体保存方面的研究报道几乎是空白，对保存影响因素的研究及分析也很少。

应用缓慢生长法在培养基中加入生长抑制剂和渗透物质对非洲菊试管苗进行保存，既可以在需要时进行快速繁殖，又可以延长保存周期，达到中期保存非洲菊种质的目的。因此，有关科研单位和高校应开展非洲菊种质资源离体保存研究，并进行遗传稳定性相关试验，为非洲菊离体保存提供有力的数据保障和技术支撑。