葡萄酒泥酵母制备水溶性β-D-葡聚糖工艺优化及其纯化后抗氧化性分析

杨学山，祝 霞，李 颍，杨 婷，马腾臻，韩舜愈（1.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室，甘肃 兰州 730070；3.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）



葡萄酒泥酵母制备水溶性β-D-葡聚糖工艺优化及其纯化后抗氧化性分析

杨学山1，2，祝 霞2，3，李 颍2，3，杨 婷2，3，马腾臻2，3，韩舜愈2，3
（1.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室，甘肃 兰州 730070；3.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）

以诱导自溶后的葡萄酒泥酵母细胞壁为试材，采用蛋白酶水解法，通过响应面分析法确定制备水溶性β-D-葡聚糖的最佳工艺条件，将粗品经Sephacryl S-400 HR凝胶柱层析纯化后，对其抗氧化性进行分析。结果表明，酶解制备水溶性β-D-葡聚糖的最佳工艺条件为浸提温度60 ℃、加酶量247 U/mL、pH 7.5、浸提时间1.5 h，得率为80.91%。凝胶柱层析纯化后得到3 种组分，比例依次为组分Ⅰ 68.08%、组分Ⅱ 13.97%、组分Ⅲ 8.79%，其中组分Ⅰ分子质量为100 065.18 D。纯化后的水溶性β-D-葡聚糖清除ABTS+·、羟自由基、DPPH自由基、O2-·和螯合Fe2+的EC50值分别为2.035、6.352、16.773、5.238、1.061 mg/mL，具有良好的抗氧化活性。

葡萄酒泥酵母；可溶性β-葡聚糖；提取纯化；抗氧化

葡萄酒发酵过程中产生的大量酵母细胞中含有丰富的多糖、氨基酸、维生素、酶及矿物质，是开发生物活性物质的优良资源［1］。但在实际生产中酒泥酵母常被当作饲料、肥料甚至垃圾处理，不仅未能充分体现其经济价值，而且形成了很大的环保压力，已成为葡萄加工业亟需解决的行业性问题［2-3］。

β-D-葡聚糖约占酵母细胞壁干物质含量的60%，具有抗肿瘤、抗辐射、抗氧化等功能［4-5］，可广泛用于化妆品、食品、医药等领域［6-8］。研究［9-10］表明，酵母葡聚糖在水中的溶解度与其分子内部的聚合度、分支度和化学修饰有关，直接提取的β-D-葡聚糖水溶性差，限制了其实际应用。因此，探索安全、高效的增溶工艺，获得大分子质量的可溶性β-D-葡聚糖是促进其产业化推广的关键问题之一。目前已有通过化学修饰法制备可溶性β-D-葡聚糖的相关报道［11］，但存在潜在安全隐患；生物酶是通过特异性或非特异性地作用于葡萄糖苷键，将多糖裂解为聚合度较低的低聚糖以增强其溶解性的新方法［12］。王成龙等［13］采用葡聚糖酶降解不溶性葡聚糖，由于葡聚糖酶可专一作用于葡聚糖主链的β-1，3-D-糖苷键，很容易将多糖降解为分子质量过低的低聚糖或寡糖，从而严重影响其生物活性，使获得的水溶性多糖失去应用价值。近年来，一些非专一性酶受到了重视，余奕珂等［14］采用来自于芽孢杆菌的Alcalase蛋白酶将酵母葡聚糖水解为分子质量较大的可溶性低聚糖，且保持了多糖生物活性及功能。

本实验以诱导自溶后的葡萄酒泥酵母细胞壁为原料，采用响应面分析法对酶法水解制备水溶性β-D-葡聚糖的工艺进行优化，并将粗品经Sephacryl S-400 HR凝胶柱层析纯化后，系统研究其体外抗氧化作用，以期为降低酵母多糖生产成本、拓展应用领域、促进葡萄酒泥酵母的资源化开发提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄酒酵母泥 甘肃祁连葡萄酒业有限公司；葡萄糖标准品 美国Sigma公司；中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶 中国Biosharp公司；兰色葡聚糖、Dextran标准品 美国Pharmacia公司；2，2′-联氮基-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2，2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）、菲洛嗪、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH） 上海源叶生物科技有限公司；冰乙酸、异丙醇、无水乙醇、氯化钠、乙酸钠、蒽酮、乙二胺四乙酸等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TDZ5-WS湘仪离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；HH-1数显恒温水浴锅 上海梅香仪器有限公司；TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；PHS-3C型pH计 上海雷磁有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水溶性β-D-葡聚糖提取工艺流程

葡萄酒泥→诱导自溶→除甘露聚糖→除脂质→酶解→乙醇醇析（酶解液-乙醇体积比2∶1，12 h）→丙酮、乙醚洗涤（15 min，2 次）→透析→冷冻干燥→水溶性β-D-葡聚糖样品

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 酵母自溶

参照本实验室已建立的方法，称取4 g葡萄酒泥酵母，溶于质量分数2% NaCl溶液、pH 4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液，47.5 ℃诱导自溶33 h。

1.3.2.2 除甘露聚糖

称取2.5 g自溶后的酵母细胞壁，以料液比1∶23在124 ℃条件下（高温灭菌锅）热水浸提5 h，离心后取沉淀。

1.3.2.3 除脂质

将沉淀用蒸馏水洗涤2～3 次，加入3 mL体积分数为4%的冰乙酸溶液，室温条件下放置2 h，将离心后的沉淀用蒸馏水洗涤2 次，以料液比1∶2加入异丙醇，4 ℃静置过夜，离心取沉淀。

1.3.2.4 酶解

向沉淀中加一定量酶液，在适当pH值及温度条件下酶解一定时间，85 ℃灭酶15 min，离心取上清液。

1.3.2.5 透析

向上清液加入无水乙醇醇析，丙酮、乙醚洗涤后沉淀用蒸馏水溶解，所得溶液依次用蒸馏水透析48 h、蒸馏水透析24 h，透析完成后，将透析袋（8 000～14 000 D）内溶液进行冷冻干燥，即得水溶性β-D-葡聚糖。

1.3.3 水解酶的筛选

以中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶3 种蛋白酶为水解酶，在其各自最适酶解条件（参照产品说明书）下水解3 h（表1），以水溶性β-D-葡聚糖得率为评价指标，对3 种不同蛋白酶的酶解效果进行评价，筛选水解效果较好的酶。

表1 不同酶的最适酶解条件Table 1 Optimale nzymatich ydrolysisc on diti on sf ord ifferente nzymes

1.3.4 单因素试验设计

称取1 g葡聚糖沉淀，分散到20 mL的磷酸缓冲溶液中，加入碱性蛋白酶进行水解，分别考察浸提温度（50、55、60、65、70 ℃）、浸提时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、加酶量（100、150、200、250、300 U/mL）和缓冲液pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）对水溶性β-D-葡聚糖得率的影响。

1.3.5 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，以水溶性β-D-葡聚糖得率为响应值，设计四因素三水平的响应面分析试验，优化提取工艺。

1.3.6 水溶性β-D-葡聚糖含量测定

1.3.6.1 标准曲线的制作

参照文献［15］的方法并修改，准确配制葡萄糖质量浓度为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL，加入4 mL 0.2%蒽酮试剂，混合均匀后迅速冷却，煮沸10 min后取出，迅速冷却，室温放置10 min。于620 nm波长条件下比色，记录吸光度。以葡萄糖标准品质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得标准曲线方程为：y=7.202 9x+0.001 9，相关系数R2=0.999 3。

1.3.6.2 样品制备及测定

称取固体样品25 mg放入水解管中，加入2.7 mol/L的H2SO46.75 mL后封管，置于100 ℃沸水浴中水解3 h，冷却至室温，水解液转入容量瓶定容备用。取样液1 mL，按1.3.6.1节方法测吸光度，以标准曲线方程计算水溶性β-D-葡聚糖质量浓度。

1.3.7 水溶性β-D-葡聚糖得率计算

1.3.8 水溶性β-D-葡聚糖凝胶柱层析

1.3.8.1 水溶性β-D-葡聚糖纯化

取制备的水溶性β-D-葡聚糖样品进行凝胶柱层析，将其上样到已平衡好的Sephacryl S-400 HR凝胶柱（1.0 cm×50 cm）上。其中，上样量为10 mg，上样体积为1 mL，用含0.5 mol/L的NaCl溶液进行洗脱，洗脱流速为2 mL/min，自动收集器收集洗脱液，每管馏分2 mL，采用紫外分光光度法进行跟踪检测，收集合并主峰，测定水溶性β-D-葡聚糖含量［16］。

1.3.8.2 水溶性β-D-葡聚糖相对分子质量测定

凝胶柱用0.5 mol/L的NaCl溶液平衡60 h后分别用3 mg兰色葡聚糖和Dextran标准品（T500、T70、T40、T10）相继上柱，测得外水体积V0和洗脱体积V，以分子质量对数lgMw为纵坐标，V/V0为横坐标绘图，制作标准曲线。

将纯化的水溶性β-D-葡聚糖上样，分部收集流出液（1 mL/管）。水溶性β-D-葡聚糖采用蒽酮-硫酸法检测糖峰，分别测定洗脱体积V1，依据V1/V0从标准曲线求得样品分子质量［17］。

1.3.9 水溶性β-D-葡聚糖体外抗氧化活性测定

1.3.9.1 抗氧化物制备

参照文献［18］方法并修改，将分离制备的水溶性β-D-葡聚糖，采用活性炭脱色法去除其中的色素成分，100 ℃加热浓缩、干燥后配制质量浓度为1.1、1.6、2.1、2.6、 3.1、3.6、4.1 mg/mL的水溶性β-D-葡聚糖测定液，并配制相同质量浓度的阳性对照VC和EDTA溶液。

1.3.9.2 ABTS+·清除能力测定

参照文献［19］方法并修改。以VC作阳性对照，计算如式（2）所示：

式中：A0为ABTS工作液和乙醇的吸光度；A1为ABTS工作液和水溶性β-D-葡聚糖的吸光度。

1.3.9.3 羟自由基清除能力测定

参照文献［20］。以VC为阳性对照，计算如式（3）所示：

式中：A0为空白对照吸光度；A1为水溶性β-D-葡聚糖存在条件下的吸光度；A2为只含水溶性β-D-葡聚糖的吸光度。

1.3.9.4 DPPH自由基清除能力测定

参照文献［20］。以VC为阳性对照，计算如式（4）所示：

式中：A0为DPPH和磷酸钠盐缓冲液的吸光度；A1为DPPH和水溶性β-D-葡聚糖溶液的吸光度；A2为水溶性β-D-葡聚糖和磷酸钠盐缓冲液的吸光度。

参照［21］方法并修改。以VC为阳性对照，计算如式（5）所示：

式中：ΔA0为邻苯三酚自氧化速率；ΔA1为加入水溶性β-D-葡聚糖水解液后邻苯三酚的氧化速率；A2为只含水溶性β-D-葡聚糖时的吸光度。

1.3.9.6 Fe2+螯合能力测定

参照［20］方法并修改。以EDTA为阳性对照，计算如式（6）所示：

式中：A0为不含水溶性β-D-葡聚糖的吸光度；A1为在水溶性β-D-葡聚糖存在时的吸光度。

1.3.10 半数有效浓度（median effective concentration，EC50）计算

EC50是指清除率为50%时水溶性β-D-葡聚糖、VC或EDTA的质量浓度，采用Logit回归计算。EC50可作为评价抗氧化能力的重要参数，如某种物质的EC50低于10 mg/mL，则表明其具有很好的抗氧化活性［22］。

1.4 数据分析

实验设3次重复，数据采用Excel 2007软件进行整理和图表处理，SPSS 17.0进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 水解酶筛选结果

图1 3 种酶对水溶性 β-D-葡聚糖酶解效果Fig.1 Comparison of extraction efficiencies of water-soluble β-D-glucan with three enzymes

由图1可知，3 种蛋白酶中碱性蛋白酶对β-D-葡聚糖水溶化效果最好，在酶解时间为1.5 h时水溶性β-D-葡聚糖得率最大，达70.70%。胰蛋白酶和中性蛋白酶分别在1.5、2.0 h时达到最大52.66%和53.26%，均低于碱性蛋白酶。因此，选择碱性蛋白酶为水溶性β-D-葡聚糖制备工艺优化的最适用酶。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 浸提温度对水溶性β-D-葡聚糖提取的影响

图2 浸提温度对水溶性 β-D-葡聚糖得率的影响Fig.2 Effect of temperature on the yield of water-soluble β-D-glucan

由图2可知，浸提温度为60 ℃时，水溶性β-D-葡聚糖得率最大，为71.76%，所以选择60 ℃为制备水溶性β-D-葡聚糖的较佳温度。当温度小于或大于60 ℃时，都会使得率降低，这是由于温度较低，活化分子数较少，未达到酶促反应的最适温度，反应不充分；温度过高，会增加构成酶本身蛋白质结构的分子热能，增加多重弱非共价键相互作用破裂的机会，最终导致酶的变性，导致水溶性β-D-葡聚糖得率下降［23］。

2.2.2 浸提时间对水溶性β-D-葡聚糖提取的影响

图3 浸提时间对水溶性 β- D-葡聚糖得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the yield of water-soluble β-D-glucan

由图3可知，浸提时间不同，水溶性β-D-葡聚糖得率也有所不同。当浸提时间为1.5 h时，水溶性β-D-葡聚糖得率最大，为71.01%，所以选择1.5 h为制备水溶性β-D-葡聚糖的较佳时间。当浸提时间小于1.5 h时，酶解过程不彻底，水溶性β-D-葡聚糖得率较低；若时间过长，会使葡聚糖降解，杂质相应的也被提取出来，也会导致得率降低［24］。

2.2.3 加酶量对水溶性β-D-葡聚糖提取的影响

图4 加酶量对水溶性 β- D-葡聚糖得率的影响Fig.4 Effect of enzyme dosage on the yield of water-soluble β-D-glucan

由图4可知，随着加酶量的增加，水溶性β-D-葡聚糖得率呈现一个先上升后下降的趋势，在加酶量为250 U/mL时得率最大，为79.06%，因此选择250 U/mL为制备水溶性β-D-葡聚糖的较佳加酶量。当加酶量低于250 U/mL时，酶未能充分与底物接触并发挥水解作用，水解不彻底，导致得率降低［23］；酶量过大，会大量作用于己经水解的葡聚糖，产生二糖、单糖等，从而导致水溶性β-D-葡聚糖得率降低。

2.2.4 pH值对水溶性β-D-葡聚糖提取的影响

图5 p H 值对水溶性 β-D-葡聚糖得率的影响Fig.5 Effect of pH on the yield of water-soluble β-D-glucan

由图5可知，不同pH值处理对水溶性β-D-葡聚糖的制备也有较明显影响。随着pH值的升高，水溶性β-D-葡聚糖得率增大，pH值达到7.5时得率最大，为79.06%。随后当pH值升高到8.0时，葡聚糖得率有轻微下降。究其原因是由于不同pH值处理会影响水解酶的活性，当pH值为7.5时，达到酶的最适pH值，水解效果最明显，而当pH值偏离最适pH值时，会对酶的空间结构造成破坏，使酶活降低。但由于所用碱性蛋白酶的最适pH值范围为7.0～8.0，因此，水溶性β-D-葡聚糖得率下降较少。

2.3 响应面试验结果

2.3.1 回归模型的确定

表2 Box-Behnken响应面试验结果Table 2 Results of Box-Behnken resp on se surfaceexperiments

利用Design-Expert 7.0软件对表2进行二次多项回归拟合试验和方差分析，反映浸提温度、浸提时间、加酶量和pH值对水溶性β-D-葡聚糖得率的影响，拟合所得多元二次回归方程如下：

该方程决定系数R2=0.984 3，校正决定系数R=0.968 7，因此，可以充分描述独立变量对水溶性β-D-葡聚糖得率的影响。该模型回归方程P值小于0.000 1，模型极显著，模型拟合程度良好。

2.3.2 回归方程的方差分析

表3 回归方程各项的方差分析Table3 Analysis of variancef ora llthe terms of the regressi on e quati on

由表3可以看出，水溶性β-D-葡聚糖得率方程的一次项X3显著，二次项极显著，说明各具体因素对响应值的影响不是简单的线性关系。交互项X1X2、X1X4及X3X4极显著，说明X1和X2、X1和X4、X3和X4之间的交互作用很好，整个响应面基于各因素间的交互作用构成。另外，模型的变异系数为1.51%，证明回归方程拟合程度较好，说明试验具有很高的可信性和准确性。失拟项不显著，说明试验的误差很小。各因素的F值可以反映其对试验指标的重要性。F值越大，对试验指标的影响越大。从方差分析表可知各因素对水溶性β-D-葡聚糖得率的影响程度大小顺序为：加酶量＞浸提温度＞浸提时间＞pH值。

2.3.3 各因素之间交互作用的响应面分析

图6 各因素交互作用对水溶性 β-D-葡聚糖得率影响的响应面Fig.6 Response surface plots showing the effect of temperature， time，enzyme dosage and pH on the yield of water-soluble β-D-glucan

由图6及回归方程方差分析可知，因素X1与X2、X1与X4、X3与X4交互作用显著，而X1与X3、X2与X3及X2与X4之间的交互作用不显著。

2.3.4 验证实验结果

由响应面和等高线图以及回归方程分析可知，制备水溶性葡萄酒泥酵母β-D-葡聚糖最佳工艺条件为：浸提温度59.82 ℃、浸提时间1.5 h、加酶量247.47 U/mL、pH 7.48。为检验响应面法所得结果的可靠性，采用上述优化提取条件制备水溶性β-D-葡聚糖，考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为浸提温度60 ℃、浸提时间1.5 h、加酶量247 U/mL、pH 7.5。按上述条件进行试验结果的验证，重复3次实际测得的水溶性β-D-葡聚糖得率分别为80.28%、81.12%、81.33%，平均得率为80.91%，与理论预测值（79.86%）相比，其相对误差约为1.31%。说明通过响应面优化得到的回归方程具有一定的实践指导意义。

2.4 分子质量测定结果

2.4.1 水溶性β-D-葡聚糖纯化

图7 水溶性 β-D-葡聚糖 S ep ha cry l S-400 HR柱凝胶层析洗脱曲线Fig.7 Elution curve of water-soluble β-D-glucan on Sephacryl S-400 HR column

由图7可知，不溶性β-D-葡聚糖经酶解后形成了片段不均一的水溶性糖成分，水解产物分为3类，分子质量较大的多糖组成的组分Ⅰ、分子质量较小的低聚糖组成的组分Ⅲ，以及分子质量介于两者之间的寡聚糖组成的组分Ⅱ。经蒽酮-硫酸法测定水溶性β-D-葡聚糖中各组分比例依次为组分Ⅰ 68.08%，组分Ⅱ13.97%，组分Ⅲ 8.79%。

2.4.2 分子质量计算结果

经Sephacryl S-400 HR凝胶层析，根据V/V0和标准品分子质量求得方程y=-0.632 7x+6.714 9，R²=0.991 7。以葡萄酒泥水溶性β-D-葡聚糖的洗脱体积V1/V0，最终得水溶性β-D-葡聚糖（组分Ⅰ）的分子质量为100 065.18 D。

2.5 水溶性β-D-葡聚糖体外抗氧化活性测定结果

2.5.1 水溶性β-D-葡聚糖对ABTS+·清除能力

由图8可知，水溶性β-D-葡聚糖清除ABTS+·能力存在质量浓度相关性。在0～4.1 mg/mL范围内清除率增加趋势较稳定；而VC在0～1.1 mg/mL范围内对其清除率迅速增加，1.1～4.1 mg/mL范围内增加趋势相当缓慢。当质量浓度达到4.1 mg/mL时，水溶性β-D-葡聚糖和VC 对ABTS+·清除率分别为73.16%、98.92%，EC50分别为2.035、0.467 mg/mL。

图8 水溶性 β- D-葡聚糖及 V C 对 A B TS +·的清除作用Fig.8 Scavenging effects of water-soluble β-D-glucan and VC against ABTS+·

2.5.2 水溶性β-D-葡聚糖对羟自由基清除能力

图9 水溶性 β-D-葡聚糖及 V C 对羟自由基的清除作用Fig.9 Scavenging effects of water-soluble β-D-glucan and VC against hydroxyl radical

由图9可知，水溶性β-D-葡聚糖具有一定的羟自由基清除能力，清除率随质量浓度的增加而增大。在0～3.1 mg/mL时，水溶性β-D-葡聚糖对羟自由基清除率增加缓慢，3.1～4.1 mg/mL范围内出现较明显的上升；而VC在0～1.1 mg/mL范围时，清除率增加明显，之后趋势变缓。当二者质量浓度达到4.1 mg/mL时，水溶性β-D-葡聚糖和VC对羟自由基清除率分别为36.49%、99.02%，EC50分别为6.352、0.603 mg/mL。

2.5.3 水溶性β-D-葡聚糖对DPPH自由基清除能力

图10 水溶性 β- D-葡聚糖及 V C 对 D PP H自由基的清除作用Fig.10 Scavenging effects of water-soluble β-D-glucan and VC against DPPH radical

由图10可知，水溶性β-D-葡聚糖对DPPH自由基的清除能力在整个测试质量浓度范围内变化不明显。当质量浓度由1.1 mg/mL升高至4.1 mg/mL时，水溶性β-D-葡聚糖对DPPH自由基清除率由7.42%升高至21.51%，比阳性对照VC（98.89%）低77.38%。水溶性β-D-葡聚糖和VC清除DPPH自由基的EC50分别为16.773、0.440 mg/mL。

图11 水溶性 β-D-葡聚糖及 V C 对 O ¯·的清除作用2Fig.11 Scavenging effects of water-soluble β-D-glucan and VC against O

2.5.5 水溶性β-D-葡聚糖对Fe2+螯合能力

图12 水溶性 β-D-葡聚糖及 E D T A对 F e2+的螯合作用Fig.12 Fe2+ Chelating effects of water-soluble β-D-glucan and EDTA

由图12可知，水溶性β-D-葡聚糖具有较强的Fe2+螯合能力。当质量浓度达到4.1 mg/mL时，水溶性β-D-葡聚糖对Fe2+螯合率为89.85%，EDTA螯合率为95.61%，EC50分别为1.061、0.232 mg/mL。

3 结 论

以诱导自溶后的葡萄酒泥酵母细胞壁为试材，采用响应面分析法优化了酶解制备水溶性β-D-葡聚糖的提取工艺条件。结果显示，在酶解温度60 ℃、加酶量247 U/mL、pH 7.5的条件下酶解1.5 h制备得水溶性β-D-葡聚糖得率最大，达80.91%。经Sephacryl S-400 HR凝胶柱层析纯化后，水溶性β-D-葡聚糖中3 种组分比例依次为组分Ⅰ68.08%，组分Ⅱ 13.97%，组分Ⅲ 8.79%，其中组分Ⅰ分子质量为100 065.18 D。

体外抗氧化活性研究结果表明，水溶性β-D-葡聚糖对不同的自由基均有抗氧化作用。对清除ABTS+·、羟自由基、DPPH自由基、O·和螯合Fe2+的EC50分别为2.035、6.352、16.773、5.238 mg/mL和1.061 mg/mL，尤其对ABTS+·、O·的清除及螯合Fe2+作用尤为显著。因此，从葡萄酒泥酵母中制备纯化的水溶性β-D-葡聚糖是一种良好的天然抗氧化剂，可以应用于食品、化妆品等行业。

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Purification and Antioxidant Activities of Water-Soluble β-D-Glucan from Waste Wine Yeast

YANG Xueshan1，2， ZHU Xia2，3， LI Ying2，3， YANG Ting2，3， MA Tengzhen2，3， HAN Shunyu2，3
（1.College of Life Science and Technology， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China；2.Key Laboratory of Viticulture and Oenology， Gansu Province， Lanzhou 730070， China；3.College of Food Science and Engineering， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China）

An enzymatic method was used to prepare water-soluble β-D-glucan from the autolyzed cell wall of waste wine yeast.Single factor method and response surface methodology were applied to optimize the extraction conditions.The watersoluble β-D-glucan was purified by Sephacryl S-400 HR gel column chromatography to investigate its antioxidant activities.The optimum conditions for β-D-glucan extraction were determined as follows： temperature， 60 ℃； enzyme dosage， 247 U/mL；pH， 7.5； and time， 1.5 h.Under these conditions， the yield of water-soluble β-D-glucan was 80.91%.Three components designated asⅠ， Ⅱ and Ⅲ were eluted from the chromatographic column， the contents of which were 68.08%， 13.97% and 8.79%， respectively.The relative molecular weight of componentⅠ was 100 065.18 D.Antioxidant activity studies showed that the purifed water-soluble β-D-glucan had good antioxidant activities with EC50values for scavenging， 2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate （ABTS+·）， hydroxyl radical， 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical （DPPH） radical and superoxide anion radical and chelating Fe2+of 2.035， 6.352， 16.773， 5.238 and 1.061 mg/mL， respectively.

wine yeast； water-soluble β-D-glucan； extraction and purification； antioxidant activities

10.7506/spkx1002-6630-201614005

TS261.9

A

1002-6630（2016）14-0024-08

杨学山， 祝霞， 李颍， 等.葡萄酒泥酵母制备水溶性β-D-葡聚糖工艺优化及其纯化后抗氧化性分析［J］.食品科学， 2016，

37（14）: 24-31.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614005. http://www.spkx.net.cn

YANG Xueshan， ZHU Xia， LI Ying， et al.Purification and antioxidant activities of water-soluble β-D-glucan from waste wine yeast［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 24-31.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614005. http://www.spkx.net.cn

2015-11-25

甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目（GNSW-2013-21）

杨学山（1977—），男，副教授，硕士，研究方向为生物化学与生物产品开发。E-mail：yangxs@gsau.edu.cn