徐州北郊鱼塘水体细菌多样性研究及致病菌分析

徐秀丽，殷婷婷，温洪宇，孙怡，高霞莉

（江苏师范大学生命科学学院，江苏　徐州　221116）

徐州北郊鱼塘水体细菌多样性研究及致病菌分析

徐秀丽，殷婷婷，温洪宇，孙怡，高霞莉

（江苏师范大学生命科学学院，江苏徐州221116）

鱼塘的健康养殖受到多种因素的制约，如鱼的种类以及鱼塘的面积大小等，同时，鱼塘水体中的细菌对鱼类存活更是带来重大影响。本文对徐州北郊鲫鱼鱼塘水体中细菌多样性及致病菌对鲫鱼存活状况的影响进行了研究，为补充完善我国鱼塘养殖环境中微生物的物种资源及鱼塘健康养殖提供了重要参考依据，旨在进一步实现鱼塘的科学管理。水样采集于夏季6月份，为鱼病频发季节，气温与水温相对较高，鱼塘中细菌数量多。研究主要是通过对鲫鱼鱼塘水体中细菌的总DNA进行提取，经过PCR扩增并依据16S rRNA基因序列构建系统发育树，进行分子发育学研究，最后获得水体中细菌物种的组成。它们分别为崛越氏芽孢杆菌（Bacillus horikoshii）、Aeromonas punctata、Bacillus thaonhiensis、溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）、弗氏志贺菌（Shigella flexneri）、印度芽孢杆菌（Bacillus indicus）、Fictibacillus phosphorivorans、Enterobacter soli、Bacillus aryabhattai。经检测其中Aeromonas punctata、弗氏志贺菌（Shigella flexneri）及溶血性葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）为致病菌。

多样性；阳性菌；阴性菌；致病菌；16S rRNA；系统发育树

随着科学技术的进步，人们生活质量逐渐提高，水产品的日需量呈上升趋势，使得我国的水产养殖业有很大的发展［1］。鱼塘养殖是我国饲养食用鱼的重要手段之一，在养殖过程中，鱼塘水体中的细菌对鱼类的生存带来了很大的影响。在整个生态系统中，细菌占据重要地位，对鱼塘环境中的物质循环有很大影响，它不仅作为分解者，也是鱼类重要的生存指标［2］，且细菌在促进水体有机物分解、营养盐释放和保持良好的水质方面也发挥了极大的作用［3］。

近年来，很多国内外科学家对鱼塘中的细菌做出分析与研究，包括细菌的多样性、群落结构、对鱼类生存的影响、特殊菌株细胞生活机制等。如Ahmed H.Al-Harbi等研究沙特阿拉伯某鱼塘水体底泥中细菌群落随季节变化的特点，发现不同季节鱼塘水体底泥中的细菌数量各不相同，其中夏季鱼塘水体底泥中细菌的数量达到了高峰［4-5］；程莹寅等对养殖草鱼鱼塘水体中细菌的多样性特征进行了研究，表明鱼塘水体底泥中细菌含量十分丰富且存在致病菌种，给鱼塘中草鱼的生存带来威胁［6］；邵桂元等对影响鱼类健康的细菌进行了研究，发现蛭弧菌可减少鱼塘中鱼类疾病的发生，降低鱼类病死率［7］；杨艳等人研究了巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）对养殖鱼塘水质的影响，发现其对鱼塘水质净化具有明显作用［8］。充分研究徐州北郊鲫鱼鱼塘水体中细菌的数量变化及致病菌对生存的影响将有助于我们了解鱼塘生态系统中的这一重要资源，给鱼类养殖模式的优化及有效控制病害发展带来重大的意义［9］。

16S rRNA基因序列检测技术近年来应用广泛，如曹波等人曾利用16S rRNA基因测序技术检测长江口细菌得到细菌群落组成［10］；朱诗应等的研究表明16S rDNA测序技术能够区分细菌并将其鉴定到具体种水平［11］。16S rRNA基因是核糖体RNA的一个小亚基，由16S rDNA编码而来［12］。本研究基于16S rRNA基因序列构建系统发育树进行分子发育学分析的方法检测出水体中9种不同的细菌，分析该鱼塘中细菌的多样性及致病菌的功能作用，为鱼塘健康养殖提供理论依据，进一步实现鱼塘的合理放养，科学管理。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1水样采集试验所选用的水体样品于2014 年6月采集于徐州北郊鲫鱼养殖鱼塘。用采水器采样，4℃保存。

1.1.2配制培养基试验前配制好培养基，放置在压力蒸汽灭菌器中，温度设置为121℃灭菌25 min，备用。

1.1.3主要仪器PCR扩增仪、电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、LX-100手掌型离心机、DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）、LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、DNA回收试剂盒、BIO-RAD凝胶成像系统。

1.2方法

1.2.1对菌种进行划线分离与纯化并斜面保存采取水样后，4℃保存。试验时取1 mL水样接种到灭菌后的固体培养基上，放置在37℃环境下培养3 d。对平板上的单一菌落反复划线以达到分离目的，最终得到纯菌株，接种至斜面，4℃保存。

1.2.2革兰染色若在显微镜下观察到染色结果是紫色，则可以判断为革兰阳性菌；若是红色，则判断为革兰阴性菌。

1.2.3细菌总DNA抽提及电泳分析抽提细菌的总DNA基因组于-20℃保存备用；对总DNA进行电泳，dd H2O漂洗，溴化乙啶染色最后采用BIORAD系统拍照。

1.2.4细菌的PCR扩增扩增时设置以27F和1492R分别作为正向引物和反向引物。正向引物为27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'（对应于E. coli 16S rRNA基因的8-27个碱基位置）。反向引物1492R：5'-CTACGGTTACCTTGTTACGAC-3'（对应于E.coli 16S rRNA基因的第1492—1510个碱基位置）［13］。在95℃条件下进行预变性；约5 min后变性，温度为94℃，45 s后，降温至55℃退火45s，72℃延伸1 min，此过程重复多次后得到的产物在低温条件下保存备用。

1.2.5PCR扩增产物电泳分析在冷却的1%的琼脂糖凝胶中加入3 μL扩增产物，放入到电泳槽中，在电压92V，电泳时间40 min条件下进行电泳，dd H2O漂洗，溴化乙啶染色，最后采用BIO-RAD系统拍照。

1.2.6PCR扩增产物胶回收空且干净的离心管称重；加入从凝胶上剪切下的单一目的基因条带，再称重；接着向0.1 g凝胶中加入3倍体积的溶胶液即300 μL，水浴温度为55℃，时间为10 min；将刚获得的溶液倒进吸附柱，放至管内离心，弃去上层液体，放至原管内。在吸附柱中两次分别加入700 μL、500 μL漂洗液，重复上述步骤最后洗去漂洗液；吸附柱暴露放置除掉未洗净的溶液；最后把吸附柱放在管内，加洗脱液，25℃静放3 min，离心60 s；低温保藏目的基因。

1.2.7测序测出菌种的目的基因产物序列。

1.2.8构建系统发育树用Mega 5.0软件构建系统发育树并进行分子发育学分析研究。

2　结果与分析

2.1革兰染色结果

划线分离之后获得纯种菌株，分别编号A2、A3、A4、A5、A6、B2、B3、B4、C1，其中 A2、A4、A5、B2、B3、C1染色结果为紫色，因而可以判断为革兰阳性菌；A3、A6、B4染色结果为红色，因而可以判断为革兰阴性菌。

2.2系统发育树

由图1可以看出：革兰阳性菌A2与芽孢杆菌属中的模式菌株崛越氏芽孢杆菌（Bacillus horikoshii DSM 8719T） 聚为一支，登录号为X76443，置信度为100%，两者同源性高于98%，亲缘关系相近，所以认为A2与Bacillus horikoshii属于同一物种［14］；革兰阳性菌A4与芽孢杆菌属中的模式菌株（Bacillus thaonhiensis NHI-38 T）的16S rRNA基因序列同源性高于98%，其登录号为JQ796719，置信度为100%，说明两者亲缘关系相近且属于同一物种；革兰阳性菌A5与葡萄球菌属中的 模式菌 株溶血 葡萄球 菌（Staphylococcushaemolyticus ATCC 29970 T）聚为一支，登录号为L37600，置信度为100%，两者同源性高于98%，亲缘关系相近，所以认为 A5与 Staphylococcus haemolyticus为同一物种；革兰阳性菌B2与芽孢杆菌属中的模式菌株印度芽孢杆菌（Bacillus indicus Sd/3T）聚为一支，登录号为AJ583158，置信度为100%，两者同源性高于98%，亲缘关系相近，所以认为B2与Bacillus indicus属于同一物种；革兰阳性菌B3与模式菌株（Fictibacillus phosphorivorans Ca7T T）的16S rRNA基因序列同源性达到了98%以上，其登录号为JX258924，置信度为100%，亲缘关系相近，所以认为B3与Fictibacillus phosphorivorans为同一物种，属于芽孢杆菌属；革兰阳性菌C1与芽孢杆菌属中的模式菌株（Bacillus aryabhattai B8W22T）聚为一支，登录号为HQ433471，置信度为100%且同源性高于98%，亲缘关系相近，所以认为C1与Bacillus aryabhattai属于同一物种。

图1　邻接法构建的16S rRNA基因序列的革兰阳性菌系统发育树

图2　邻接法构建的16S rRNA基因序列的革兰阴性菌系统发育树

由图2可以看出：革兰阴性菌A3与气单胞菌属中的模式菌株（Aeromonas punctata subsp.caviae ATCC 15468 T）的16S rRNA基因序列同源性达到了98%以上，其登录号为X74674，置信度为99%，亲缘关系相近，所以A3与Aeromonas punctata subsp.caviae属于同一物种；革兰阴性菌A6与模式菌株（Shigella flexneri ATCC 29903T）聚为一支，登录号为X96963，置信度为98%且同源性高于98%，亲缘关系相近，所以认为A6与Shigella flexneri属于同一物种，中文名称为弗氏志贺菌，属于志贺菌属；革兰阴性菌B4与肠杆菌属中的模式菌株（Enterobactersoli LF7aT）的16S rRNA基因序列同源性达到了98%以上，其登录号为CP003026，置信度为99%，所以两者亲缘关系相近，属于同一物种。

3　讨论

鱼塘中细菌数量随着季节交替呈现波动性变化，选择6月份采集水样是由于水体中细菌数量较多，且致病菌十分活跃，夏季光照较强，气温与水温相对较高，水中藻类数量增多，水体富营养化严重，导致水体中细菌数量大幅度增多；春季和秋季水体中细菌数量保持在一定的范围之内，冬季气温较低，水体中的细菌数量相对较少［15］。

本文所获得的9种菌株，其中A2、A4、B2、B3、C1均属于芽孢杆菌属，A3属于气单胞菌属，A5属于葡萄球菌属，A6属于志贺菌属，B4属于肠杆菌属。同时，通过检测发现水体中存在大量的致病菌，如本试验中的气单胞菌属（Aeromonas punctata）、弗氏志贺菌（Shigella flexneri） 和溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）。

文章研究的3种致病菌对鱼类均可产生一定的致病性。气单胞菌属（Aeromonas punctata）致病性很强，在淡水、海水、鱼类及脊椎动物肠道最为常见，能引起鲫鱼、鲤鱼等鱼类和家禽以及人体共同患病，故鱼塘管理人员应采取措施抑制该致病菌对鱼类的危害，从而提高该鱼塘中鲫鱼产量与质量［16］。苏国富研究表明弗市志贺菌（Shigella flexneri）是典型的致病菌，它的有毒基因分布在鱼类染色体和大质粒上，对鱼塘中如鲫鱼、罗非鱼等鱼类生长有一定的危害，表现为呼吸困难，体内供能物质合成受阻，最终耗尽营养导致重大疾病甚至死亡［17］。溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）会使鱼类皮肤受损甚至坏死，一旦作用于鱼体细胞时间过长，则会使鱼类死亡。

气单胞菌属（Aeromonas punctata）、弗氏志贺菌（Shigella flexneri）和溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）这三种致病菌会破坏鱼塘中原有的生态平衡，使鱼类的自身机能受限、发育迟缓、免疫机制受阻，患病概率增加并且病死率上升，导致鱼塘中鱼类的生存受到极大的威胁［18］。在夏季鱼类疾病高发时段，为提高产量，健康养殖，管理人员应提前做好对致病菌的防范措施，向鱼塘中投放能抑制气单胞菌属（Aeromonas punctata）、弗氏志贺菌（Shigella flexneri） 和溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）生长的抑制剂或投放如益生菌等促进鱼类生长改善水体环境的菌液并定期给鱼塘换水。另外，投放益生菌菌液不宜过多，在一定的范围内，投放菌液浓度越高效果越好，超过了某一特定范围效果则会降低［19］。

在鱼塘水体中发现的9种菌里有5种均属于芽孢杆菌，而芽孢杆菌对于鱼塘水体的影响已有许多研究，如杨莺莺等［20］研究发现鱼塘水体细菌群落特征受芽孢杆菌的影响，其通过改善代谢能力进而使细菌对有机废物的分解能力大幅提升，达到改善水质的目的；董爱华等［21］发现在罗非鱼鱼塘中添加芽孢杆菌，水体透明度明显增加，鱼塘中NH3、NH4+、H2S等含量明显下降，同时有害藻繁殖速度明显降低，该研究表明芽孢杆菌属能改良水体水质，预防鱼类疾病。可见徐州北郊鲫鱼鱼塘水体中的A2 （Bacillus horikoshii）、A4（Bacillus thaonhiensis）、B2 （Bacillus indicus）、B3（Fictibacillus phosphorivorans）、C1（Bacillus aryabhattai）等芽孢杆菌对于改善鱼塘水质，降低鱼类发病率有着重要作用，因此在鱼塘养殖过程中管理人员还可以通过适量投放芽孢杆菌作为益生菌的方法，更大程度上净化鱼塘水质，提高鱼类产量。

［1］易戈，黎娅，容元平，等.利用微生物净化鱼塘养殖污染水的研究［J］.湖北农业科学，2010，49（10）:2509-2511.

［2］刘国才，包文仲，刘振奇，等.鱼塘内细菌数量消长和季节变动［J］.水产学报，1992，16（1）:24-30.

［3］丁庆秋，彭建华.水产健康养殖的水质管理［J］.养殖与饲料，2014（9）:25-29.

［4］Ahmed H.Al-Harbi，M.Naim Uddin.Seasonal Changes in Bacterial Flora of Fish Pond Sediments in Saudi Arabia［J］. Journal of Applied Aquaculture，2006，18（2）：35-45.

［5］Ahmed H.Al-Harbi，M.Naim Uddin.Aerobic Bacterial Flora of Common Carp（Cyprinus carpio L.）Cultured in Earth－en Ponds in Saudi Arabia［J］.Journal of Applied Aquaculture，2008，20（2）：108-119.

［6］程莹寅，吴山功，郑英珍，等.主养草鱼池塘底泥微生物群落多样性研究［J］.淡水渔业，2011，41（6）:43-49.

［7］邵桂元，沈启华，朱大义.鱼类致病菌的蛭弧菌研究［J］.微生物学杂志，1993，13（2）:50-52.

［8］杨艳，刘萍，马鹏飞，等.巨大芽孢杆菌MPF-906对养鱼水质净化的初步研究［J］.水产养殖，2007，28（3）:6-8.

［9］杨彩霞，王崇明，李赟，等.应用DGGE技术分析流清河湾扇贝养殖海区细菌群落结构的季节变化 ［J］.水产学报，2012，36（3）:407-414.

［10］曹波，杨红，许强华，等.基于16SrRNA技术的长江口微生物分子生物学鉴定与分析［J］.上海海洋大学学报，2011，20 （2）:191-196.

［11］朱诗应，戚中田.16S rDNA扩增及测序在细菌鉴定与分类中的应用［J］.微生物与感染，2013，8（2）:104-105.

［12］雷正瑜.16SrDNA序列分析技术在微生物分类鉴定中的应用［J］.湖北生态工程职业技术学院学报，2006，4（1）:4-7.

［13］陈火胜.通用引物PCR技术的应用概况［J］.中国病毒学，1994（04）:279-282.

［14］何亮，谢小军，王冲，等.16S rRNA序列同源性分析结合系统发育树构建鉴定6株生殖道乳杆菌［J］.中华全科医学，2013，11（4）:617-618.

［15］陶妍，骆肇荛.高产池塘养殖鱼细菌污染的季节变化［J］.水产学报，1996，20（1）:92-96.

［16］Martinez-Murcia AJ，Benlloch S，Collins MD.Phylogenetic interrelationships of members of the genera Aeromonas and plesiomonas as determined by 16S ribosomal DNA sequencing:lack of congruence with results of DNA-DNA hybridizations［J］.International journal of systematic bacteriology，1992，42（3）:412-421.

［17］苏国富.志贺氏菌属的致病因子及其菌苗研究进展［J］.引进国外医药技术与设备，1998，4（3）:107-120.

［18］张文魁.鱼塘养殖污染的原因及防治技术［J］.现代农业科技，2010（3）:355-359.

［19］孙云章.鱼类肠道功能微生物与益生菌开发应用策略［J］.当代水产，2014（2）:83-85.

［20］杨莺莺，李卓佳，梁晓华，等.芽孢杆菌对鱼池微生物群落代谢功能影响［J］.微生物学杂志，2009，29（3）:11-17.

［21］董爱华，吴迪，陈训银.芽孢杆菌对罗非鱼养殖水体水质的影响［J］.饲料与畜牧，2012（2）:21-26.

Study on bacterial diversity and analysis of pathogenic bacteria in fish pond water in the north of Xuzhou

Xu Xiuli，Yin Tingting，Wen Hongyu，Sun Yi，Gao Xiali
（School of Life Science Jiangsu Normal University，Xuzhou 221116，China）

Healthy breeding of fish ponds restricted by many factors，such as the types of fish and fish ponds area size，etc.，at the same time，the bacteria in fish pond water for fish survival but also bring significant impact. Study on the effect of bacterial diversity and pathogen on fish survival status of the fish pond water in the north of Xuzhou can not only improve our microbial species resources of aquiculture environment，but also provide an important reference for the healthy breeding of the fish ponds.Water samples were collected in the summer of June，the temperature and the temperature is relatively high.The research is mainly through 16S rRNA gene sequencing of the fish pond water bacteria in the north of Xuzhou，and the 16S rRNA gene sequence analysis of phylogenetic tree construction，finally get the composition of bacterial species in water.After testing，we found that there were nine kinds of bacteria in fish pond water，they were Bacillus horikoshii、Aeromonas punctata、Bacillus thaonhiensis、Staphylococcus haemolyticus、Shigella flexneri、Bacillus indicus、Fictibacillus phosphorivorans、Enterobacter soli、Bacillus aryabhattai.The Aeromonas punctata、Staphylococcus haemolyticus and Shigella flexneri were pathogenic bacteria.

diversity；Gram-negative bacteria；Gram-positive bacteria；pathogenic bacteria；16S rRNA；Phylogenetic tree

S949

A

1004-2091（2016）01-0019-05

10.3969/j.issn.1004-2091.2016.01.004

江苏省大学生实践创新训练计划项目（201410320026）

徐秀丽（1993-），女，理学学士，研究方向：微生物学.E-mail：821311076@qq.com

温洪宇（1973-），男，副教授，硕士生导师，主要从事环境微生物学研究.E-mail:wenhy2007@126.com

2015-06-17）