尾巨桉3个无性系继代增殖培养研究

石 前， 李飞宇， 梁秀莉， 邓冬丽， 李丽芳， 兰 俊*

(1. 广西壮族自治区国有东门林场，广西扶绥 532108；2. 中种国际种子有限公司，北京100028)



尾巨桉3个无性系继代增殖培养研究

石 前1， 李飞宇2， 梁秀莉1， 邓冬丽1， 李丽芳1， 兰 俊1*

(1. 广西壮族自治区国有东门林场，广西扶绥 532108；2. 中种国际种子有限公司，北京100028)

摘要[目的]研究尾巨桉3个无性系继代增殖培养技术，为尾巨桉苗木快速繁殖提供理论依据。[方法]以尾巨桉3个无性系DH32-26、DH32-29、DH32-28为试验材料，筛选最佳的植物生长调节剂组合、凝固剂、暗培养天数和培养瓶，达到较高的继代增殖系数。[结果] 3个无性系继代增殖培养时最适的植物生长调节剂组合为：DH32-26(6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L)；DH32-28(6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L)；DH32-29(6-BA 0.3 mg/L+NAA0.2 mg/L)；DH32-26的继代增殖系数在凝固剂为卡拉胶和琼脂的培养基中差异不大，DH32-28、DH32-29的继代增殖系数在以卡拉胶作为凝固剂的培养基中比在以琼脂作为凝固剂的培养基中有所提高，在生根培养过程中，以卡拉胶作为凝固剂的培养基远比用琼脂作为凝固剂的培养基诱导出根好；继代增殖初期DH32-26、DH32-28需用黑布进行全暗遮光5～10 d，而DH32-29不需全暗培养；用广口瓶继代增殖培养DH32-29可降低苗木生产成本，但DH32-26、DH32-28不适合用广口瓶进行继代增殖培养。[结论]要提高无性系继代增殖系数，需要选取最优的植物生长调节剂组合、凝固剂、暗培养天数和培养瓶。

关键词尾巨桉；无性系；继代增殖

目前在造林中推广应用较多的无性系是尾巨桉系列的优良无性系，已应用于造林的尾巨桉优良无性系主要有DH32-29、DH32-28、DH32-26、DH32-27、DH32-13等。其中DH32-26在速丰林高产竞赛评比活动中，年均蓄积生长量优于其他品种，被评为最优品种。根据造林试验效果反馈，DH32-29和DH32-28也获得了较好的评价。从选育到推广造林，尾巨桉无性系在广西和华南地区的桉树造林中占据重要地位，为林浆纸板一体化的发展做出巨大贡献，产生了巨大的经济效益和社会效益。

在生产中，单一无性系造林易受病虫的袭击，给造林户造成直接经济损失，采用多种无性系造林对林分的稳定性有一定的促进作用。目前在尾巨桉组培快繁技术方面已有一定的研究，但对尾巨桉不同无性系在组织培养方面的差异性研究还较少。由于各无性系的遗传物质不同，所以在外植体诱导、继代增殖培养、生根培养、移栽方面有不同的要求。笔者以尾巨桉3个优良无性系(DH32-26、DH32-29、DH32-28)为研究对象，从继代增殖培养方面探索桉树不同无性系在组培技术上的差异性，以期完善尾巨桉的快繁技术，为尾巨桉苗木快速繁殖提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验地概况试验地位于崇左市扶绥县广西国营东门林场林业科学研究所国家良种繁育中心苗圃，107°15′～108°00′E、22°17′～22°30′N，东西长80km、南北宽20km，属于南亚热带地区，季风气候明显，年日照时数1 634～1 719h，年平均气温22 ℃，极端最高气温40 ℃，极端最低气温-4 ℃，位于十万大山的雨影区，雨量偏少，年降雨量1 100～1 300mm，相对湿度74%～83%。

1.2供试材料尾巨桉3个无性系DH32-26、DH32-29、DH32-28。

1.3研究方法

1.3.1植物生长调节剂组合对无性系继代苗增殖的影响。以改良MS为继代培养的基本培养基，添加6-BA、NAA形成6 种浓度组合的增殖培养基(表1)。各处理3个重复，每重复5瓶，每瓶接入15丛芽，每丛2～3条芽。将诱导出的无菌材料DH32-26、DH32-28、DH32-29不定芽接种到增殖培养基上培养，20d后观察各培养基丛生芽分化情况，统计继代苗平均苗高、增殖系数、生长状况及有效芽苗数，筛选出适宜的植物生长调节剂组合。

表1不同植物生长调节剂组合

Table1Combinationofgrowthregulatorsofdifferentplants

mg/L

1.3.2凝固剂对无性系继代苗增殖的影响。研究琼脂和卡拉胶2种凝固剂对不同无性系继代苗增殖的影响，琼脂用量为4g/L(1 300g/cm2强度)，卡拉胶用量6g/L。将诱导出的无菌材料DH32-26、DH32-28、DH32-29不定芽分别接种到用琼脂和卡拉胶作为凝固剂的改良MS继代培养基中，各处理3个重复，每重复5瓶，每瓶接入15丛芽，每丛2～3条芽，接种 20d后统计继代苗平均高、增殖系数、生长状况。

1.3.3暗培养天数对无性系继代苗增殖的影响。继代苗接种后，不能直接放在强光下培养，一般要暗培养一段时间。研究不同暗培养天数对不同无性系继代苗增殖的影响，试验设4个处理：黑布覆盖0 (弱光培养5d)、5、10、15d。各处理3个重复，每重复5瓶，每瓶接入15丛芽，每丛2～3条芽，25d后统计继代苗平均高、继代增殖系数、继代苗生长状况。

1.3.4培养瓶对无性系继代苗增殖的影响。采用2种培养瓶，即500mL的三角瓶和250mL的广口瓶进行继代培养，研究这2种培养瓶对尾巨桉3种无性系继代苗增殖的影响。各处理3个重复，每重复5瓶，每瓶接入15丛芽，每丛2～3条芽，20d统计继代增殖系数、平均有效芽数、继代苗生长状况。

2结果与分析

2.1植物生长调节剂组合对无性系继代苗增殖的影响植物生长调节剂是一种活性物质，对植物生长发育有调节作用。用于继代增殖培养的是能促进芽分化的细胞分裂素和促生长的生长素，具体运用时要根据需要来决定两者的比例。DH32-26在6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L培养基中叶淡绿，有效芽最多；DH32-28在6-BA0.4mg/L+NAA0.2mg/L培养基中叶色绿，芽密，有效芽最多；DH32-29在6-BA0.3mg/L+NAA0.2mg/L培养基中叶色绿而舒展，芽多而密，有效芽最多(表2)。

表2　植物生长调节剂组合对无性系继代苗增殖的影响

2.2凝固剂对无性系继代苗增殖的影响琼脂和卡拉胶同为培养材料的支撑物，由于原料不同，其对继代苗的增殖率有一定影响。研究3个无性系在琼脂和卡拉胶凝固剂中的继代增殖表现，结果表明在卡拉胶培养基中，DH32-26、DH32-28、DH32-29这3个无性系继代苗高稍高于琼脂培养基中苗高。DH32-29、DH32-28这2个无性系在卡拉胶培养基中继代增殖系数比琼脂的高，而DH32-26在卡拉胶培养基中继代增殖系数与在琼脂培养基中差别不大。各无性系在同一种凝固剂中，表现也有所不同，DH32-29继代增殖系数最高，其次为DH32-28、DH32-26(表3)。

表3　凝固剂对无性系继代苗增殖的影响

2.3暗培养天数对无性系继代苗增殖的影响光照在植物组织培养中是一个十分重要的因子，在继代苗增殖初期中，要形成大量的愈伤组织，需进行暗培养处理，一般在300～500lx的光照强度下，即放置在一般的暗培养架上弱光培养便可达到很好的增殖效果，但由于各无性系生理特点不同，这种方式达不到所需的增殖倍数，所以采用黑布覆盖的避光措施，以达到提高继代增殖率的目的。在继代培养的后期，植物对光的需求加大，避光暗培养时间过长会影响继代芽苗的质量。由表4可知，DH32-26和DH32-28全暗培养时间以10d内为宜，全暗培养时间过少苗不高，增殖系数低，过高苗水肿、纤细，DH32-29不用全暗培养也可达到好的效果。3个无性系随着暗培养时间的增加，增殖系数和苗高也增加，但当全暗培养时间超过一定天数后，会出现茎纤细、弱，木质化差，苗水肿的现象。

表4　暗培养天数对无性系继代苗增殖的影响

2.4培养瓶对无性系继代苗增殖的影响由表5可知，由于三角瓶的底径大，光线充足，采光更好，接种于三角瓶的继代苗比接种于广口瓶的继代苗增殖系数高。由于空间不足，接种于广口瓶的继代苗有效芽较少。广口瓶接受光照的面积少，对DH32-26、DH32-28这2个无性系来说其继代苗需要较强光照，用广口瓶作为继代培养瓶，分化增殖不理想，用作生根有效芽少，而三角瓶比较适合它们所需的光照，用作生根有效芽多；对DH32-29来说广口瓶作继代培养瓶的光照已经满足了它的生长，不论是用三角瓶作为继代培养瓶，还是用广口瓶作继代培养瓶都可以。

表5　培养瓶对无性系继代苗增殖的影响

3结论与建议

(1) 该试验通过用6-BA和NAA的不同配比来筛选适合3个无性系继代增殖的植物生长调节剂配方。根据试验结果可得出，DH32-26继代增殖培养适用的植物生长调节剂组合为6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L；DH32-28继代增殖培养适用的植物生长调节剂组合为6-BA0.4mg/L+NAA0.2mg/L；DH32-29继代增殖培养适用的植物生长调节剂组合为6-BA0.3mg/L+NAA0.2mg/L。继代培养的目的就是将诱导产生的芽不断扩繁，使繁殖材料增多来达到继代增殖的效果。继代培养基中，对芽器官分化起重要作用的是细胞分裂素，细胞分裂素要与生长素配合使用，在合适的配比下才能达到较好的效果[1-2]，过高或者过低都不利于继代增殖[3]。在专做继代增殖时，6-BA与NAA比值增大可提高继代增殖系数，但如果比值过大，继代苗过于细弱，玻璃化苗的几率增大。

(2) 为找出适合DH32-26、DH32-28、DH32-29无性系的暗培养方式，该试验做了4个暗培养时间处理，试验结果表明DH32-26、DH32-28这2个无性系需用黑布覆盖全暗培养5～10d，苗高和继代增殖系数会有所提高，有效芽增多，DH32-29只需弱光培养就可达到较高的继代增殖系数。桉树继代培养中，光照是一个较重要的环境因子，桉树无性系不同，对环境条件的要求也不同，继代增殖初期需要避光培养，长时间在光线不足的环境中，植物会出现玻璃化和徒长现象[4-6]。

(3)在桉树继代培养中使用的是固体培养基，琼脂和卡拉胶属于凝固剂，用于提取它们的海藻种类不同，表现特性也不同。用琼脂配制培养基，其凝固性和稳定性好，但价格较贵，用卡拉胶配制的培养基，非常透明，易于观察瓶内的培养材料。该试验用含有这2种凝固剂的培养基接入3种无性系的繁殖材料，进一步观察3种无性系在2种凝固剂培养基中继代增殖系数及苗木表现，试验结果表明DH32-28、DH32-29这2个无性系的继代增殖系数在含卡拉胶凝固剂

的培养基中稍有提高，但在此培养基中继代苗易老、黄化，当放置在温度较高(超过30℃以上)的高架炼苗时，培养基会溶解成水，继代苗没有了培养基的支撑，逐渐枯萎。卡拉胶会化为水，变成水培状，但琼脂未出现此情况，这现象说明卡拉胶的稳定性不如琼脂。

(4)工厂化育苗是进行大规模、高效率的组培苗生产，不仅对数量和质量有要求，而且要考虑如何降低生产成本，提高生产和经济效益。组培生产中用量最多的是培养瓶，如果能在此项寻找到合适的替代品，可以降低成本。目前使用继代培养的大多是三角瓶，在广东的很多组培厂使用的是广口瓶(罐头瓶)。三角瓶的价格高，1个500mL的三角瓶约6元，而广口瓶价格低，1个广口瓶0.7元，价格相差8倍左右。在节约成本的同时，也要考虑苗木的质量，为探求这2种继代培养瓶对3种无性系继代苗生长和增殖的影响，经过试验，结果表明DH32-29在2种继代培养瓶中，继代增殖系数没有大的变化，以三角瓶为培养瓶的消毒用时多，工序繁琐，而用广口瓶为培养瓶方便操作，速度快，DH32-29对光照要求不是很严格，可用2种培养瓶进行继代培养，但从成本上来说用广口瓶作继代培养瓶比较划算；DH32-26、DH32-28用广口瓶作继代培养瓶时，继代增殖有效芽少，光线太弱，而这2个无性系对光照的需求较强，用三角瓶作为继代培养瓶能满足它们对光照的需求，因此对DH32-26和DH32-28这2个无性系来说，用三角瓶作为继代培养瓶较为合适。

参考文献

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作者简介石前(1982-)，女，湖南衡阳人，工程师，硕士，从事林木良种繁育研究。*通讯作者，高级工程师，硕士，从事桉树遗传改良和无性系开发研究。

收稿日期2016-05-16

中图分类号S 722.8

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)16-179-04

MultiplicationSubcultureofThreeClonesofEucalyptus urophylla × E. grandis

SHIQian1,LIFei-yu2,LIANGXiu-li1,LANJun1*etal

(1.GuangxiDongmenForestFarm,Fusui,Guangxi532108; 2.ChinaSeedInternationalSeedCo.,Ltd.,Beijing100028)

Abstract[Objective] To research the multiplication subculture technology of three clones of Eucalyptus urophylla × E. grandis, and to provide theoretical foundation for the rapid propagation of E. urophylla × E. grandis seedlings. [Method] With three clones (DH32-26, DH32-29, DH32-28) as the test materials, the optimal combination of regulators was screened, as well as the coagulator, dark culture days and culture flask. Thus, multiplication coefficient was relatively high. [Result] The optimal combination of plant growth regulators for subculture of three clones were DH32-26(6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.2 mg/L), DH32-28(6-BA 0.4 mg/L + NAA 0.2 mg/L) and DH32-29(6-BA 0.3 mg/L + NAA 0.2 mg/L). DH32-26 multiplication coefficient showed no significant differences in culture medium with carrageenan and agar as the coagulators. Subculture multiplication coefficients of DH32-28 and DH32-29 in culture medium with carrageenan as the coagulator was higher than those with agar as the coagulator. During the process of rooting, culture medium with carrageenan as the coagulator had far better rooting than that with agar as the coagulator. In the initial stage of DH32-26 and DH32-28 subculture, black cloth was used for shading for 5-10 d; while DH32-29 did not need all dark culture. DH32-29 subculture in wild-mouth bottle reduced the production cost of seedlings; but DH32-26 and DH32-28 were not suitable for the subculture in wild-mouth bottle. [Conclusion] To enhance the multiplication coefficient of clones, we should select the optimal regulators, coagulator, dark culture days and culture flask.

Key wordsEucalyptus urophylla × E. grandis; Clones; Multiplication