两株广西地不容内生真菌的抑菌活性研究

周秋艳，卿 朕，骆海玉，周献青，池通海，邓业成

（珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室/广西师范大学生命科学学院，广西 桂林 541004）

两株广西地不容内生真菌的抑菌活性研究

周秋艳，卿 朕，骆海玉，周献青，池通海，邓业成

（珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室/广西师范大学生命科学学院，广西 桂林 541004）

从广西地不容块根分离出白壳菌Albonectria rigidiuscula DBR-3和黑孢霉属Nigrospora sp.DBR-5两株内生真菌，以15种动物病原菌和10种植物病原真菌为供试菌，对两株内生真菌的抑菌活性进行测定。结果表明，DBR-3对动物病原菌和植物病原真菌均有抑菌活性，其发酵产物的乙酸乙酯萃取物对12种动物病原菌的MIC为0.625～10 g/L，对10种植物病原真菌的EC50值为0.3437～7.7094 g/L。DBR-5对植物病原真菌的抑菌活性好，但对动物病原菌的抑菌活性差，DBR-5发酵产物的乙酸乙酯萃取物对10种植物病原真菌的EC50值为0.0124～0.6112 g/L，明显高于DBR-3对植物病原真菌的抑菌活性。

广西地不容；内生真菌；抑菌活性

周秋艳，卿朕，骆海玉，等.两株广西地不容内生真菌的抑菌活性研究［J］.广东农业科学，2016，43（4）：111-116.

植物内生真菌是在其生活史中的某阶段或全部阶段存在植物组织的一类多样性丰富的微生物类群，其次级代谢产物中存在大量具有抗炎、抗癌、抗菌等生物活性的物质［1］。内生真菌和寄主植物之间的相互作用受其共生体基因和外在环境调节的控制［2］，植物内生真菌生活于不断受到外界环境影响的寄主植物内，迫使内生真菌不断产生新的防御物质与寄主植物协同进行系统防御，同时，植物内生真菌也会受到寄主植物的刺激，产生与寄主植物相同或者相似的次生代谢物［3］，因此内生真菌已成为寻找新型活性物质的重要来源［4］。广西地不容（Stephania kwangsiensis Lo.）是广西特有的多年生草质落叶藤本植物，属防己科千金藤属山乌龟亚属［5］，生于石灰岩的石山地区，主要产于广西西北部、西南部的靖西、凌云、那坡等县，是广西壮族等少数民族民间常用草药。广西地不容块根含有丰富的生物碱，其总生物碱含量达3%～4%，具有很强的镇痛、抗炎、抑菌作用［6-7］。研究表明，生物碱还具有其他广泛的生理活性，如杀虫、抗糖尿病等［8-9］。广西地不容是生长于石灰岩地区石山上的重要药用植物，能产生大量具有药用价值的生物碱，这些生物碱已被证实具有不同的生物活性，是开发新药的天然活性物质。广西地不容分布范围窄，长期生长于土壤贫脊、干旱的特殊环境中，从中分离出特殊内生真菌并从内生真菌代谢产物中发现新的生物活性物质的可能性较大。目前国内外对广西地不容内生菌的研究尚属空白，因而使该植物的内生菌资源未能得到应用。因此，研究广西地不容内生真菌代谢产物的生物活性对寻找新型活性物质具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试植物内生真菌 白壳菌Albonectria rigidiuscula DBR-3和黑孢霉属Nigrospora sp.DBR-5：从采自广西植物研究所的广西地不容块根中分离，采用形态学和分子生物学（ITS序列分析）技术相结合的方法进行分类鉴定。

1.1.2 供试病原菌 供试动物病原菌15种：大肠杆菌Escherichia coli、产气肠杆菌Enterobacter aerogenes、伤寒沙门氏菌Salmonella typhi、痢疾志贺氏菌Shigella dysenteriae、普通变形杆菌Proteusbacillus vulgaris、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、乙型副伤寒杆菌Bacterium paratyphosum B、炭疽杆菌Bacillus anthraci、溶壁微球菌Micrococcus lysodeikticus、藤黄微球菌Micrococcus luteus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus、巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium、金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus、白色念珠菌Candida albicans，由桂林医学院微生物实验室提供。

供试植物病原真菌10种：玉米小斑病菌Bipolaris maydis、烟草黑胫病菌Phytophthora parasitica var.Nicotianae、玉米大斑病菌Exserohilum turcicum、辣椒炭疽病菌Colletotrichum capsici、甘蓝黑斑病菌Alternaria oleracea、金桔砂皮病菌Diaporthe citri、甘蔗凤梨病菌Ceratocystis paradoxa、茶轮斑病菌Pestalotiopsis theae、贡柑链格孢菌Alternaria citri、水稻胡麻叶病菌Cochliobolus miyabeanus，除金桔砂皮病菌和贡柑链格孢菌由广西特色作物研究所提供以外，其余8种均由广西大学农学院植物病理室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 内生真菌的发酵 挑取保存的纯化菌种接种于PDA平板上，待生长旺盛后，用0.4 cm打孔器在菌落平板上打取菌饼，用镊子挑取3个菌饼，接种于装有500 mL灭菌马铃薯葡萄糖液体培养基的1 000 mL锥形瓶中，置于恒温培养箱中培养，每天摇晃2～3次。培养温度为27（±1）℃，培养时间30d。

1.2.2 内生真菌粗提物的制备 将内生真菌发酵物用2层纱布过滤，分为菌饼和发酵液。得到的菌饼于60℃条件下烘干，粉碎后用5倍量的甲醇浸泡干粉，期间搅拌2～3次，24h后抽滤。浸提2次，将2次滤液合并后用旋转蒸发器减压浓缩，得菌饼提取物浓缩液。过滤得到的发酵液进一步抽滤后用旋转蒸发器减压浓缩，得发酵浓缩液。最后将菌饼提取物浓缩液和发酵浓缩液合并，蒸干溶剂，得内生真菌发酵粗提物，保存于4℃冰箱中备用。

1.2.3 内生真菌粗提物的初步分离 用液-液萃取法分离内生真菌粗提物。先用一定量的蒸馏水溶解一定质量粗提物，置于分液漏斗中，依次用等量的乙酸乙酯和正丁醇萃取，每种溶剂萃取3次，合并3次萃取液。用旋转蒸发仪减压浓缩至膏状，得到乙酸乙酯和正丁醇萃取物。

1.2.4 抑菌活性测定 （1）对动物病原菌的抑制活性测定：参考相关文献采用带毒平板法［10］。将菌种接到牛肉膏蛋白胨液体培养基（若接白色念珠菌用沙氏液体培养基）中，37（±1）℃的水浴恒温振荡器培养12～14 h进行活化。把样品配成一定浓度的药液（溶剂为丙酮和水=1∶1）。在无菌洁净工作台中，将1 mL药液与9 mL热熔牛肉膏蛋白胨培养基（白色念珠菌用沙氏培养基）混合均匀，制成厚薄均匀的带药培养基。将已活化的菌种摇匀吸取0.1 mL于9.9 mL无菌水中稀释成菌悬液。吸取0.1 mL菌悬液，加到带药培养基上，涂布均匀。每个处理3次重复。阳性对照组用溶样溶剂代替药液，其他条件不变，用于观察细菌能否正常生长。阴性对照则涂0.1 mL无菌水，其他条件不变，用于观察培养基、药液或无菌水是否污染。37 （±1）℃条件下培养48h后，观察并记录结果。

测定样品对病原菌的MIC值时，将样品配成系列浓度的药液与培养基混合，制成系列浓度的带毒培养平板。以不长菌的最低浓度作为样品对动物病原菌的MIC值。

（2）对植物病原真菌菌丝生长的抑制活性测定：参照相关文献采用菌丝生长速率法测定［11］。把样品配成一定浓度的药液（溶剂为丙酮和水=1∶1）。在无菌洁净工作台中，把1 mL药液（对照组用溶样溶剂代替）与9 mL热熔PDA培养基混合均匀，倒入直径为9 cm的培养皿中制成厚薄均匀的带药培养基。在已活化的供试菌边缘，用直径为0.4cm的无菌打孔器切取菌饼，并使菌丝面朝下接于带药培养基上，每个培养皿接3个菌饼成品字形分布，每个处理3次重复。置于27（±1）℃光照培养箱中培养72 h后，用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率：

测定有效中浓度（EC50）时，配制5个系列浓度的药液，测定各个浓度的抑菌率，用最小二乘法求出毒力回归方程、相关系数r、EC50及EC50的95%置信限。

2 结果与分析

2.1 两株内生真菌不同溶剂萃取物对15种动物病原菌的抑制活性

表1 两株内生真菌不同溶剂萃取物对15种供试动物病原菌的抑制活性

用带毒平板法测定两株内生真菌不同溶剂萃取物对15种动物病原菌的48h抑制活性，结果见表1。由表1可知，当各个萃取物浓度为10g/L时，DBR-3乙酸乙酯萃取物对12种供试动物病原菌有抑制活性，正丁醇萃取物和水萃取物对15种供试动物病原菌均无抑制活性，表明抑菌物质主要存在于乙酸乙酯萃取物中。DBR-5的3种溶剂萃取物对15种供试动物病原菌均无抑制活性。

2.2 DBR-3乙酸乙酯萃取物对12种动物病原菌的最低抑制浓度

根据表1的结果，将DBR-3乙酸乙酯萃取物配成系列梯度浓度，制成带毒平板，测定其对12种动物病原菌的48 h最低抑制浓度（MIC），结果见表2。由表2可知，DBR-3乙酸乙酯萃取物对白色念珠菌的抑制活性最高，MIC值为0.625 g/L，对其余11种动物病原菌的MIC值为2.5-10 g/L。

表2 DBR-3乙酸乙酯萃取物对12种供试病原真菌的最低抑制浓度

2.3 两株内生真菌不同溶剂萃取物对10种植物病原真菌菌丝生长的抑制活性

采用菌丝生长速率法测定浓度为5 g/L 时，两株内生真菌不同溶剂萃取物对10种植物病原真菌菌丝生长72 h的抑制活性，结果见表3。由表3可知，除DBR-3水萃取物对玉米小斑病菌菌丝生长具有促进作用，两株内生真菌不同溶剂萃取物对供试植物病原真菌菌丝生长均有抑制活性。两种内生真菌的活性物质主要存在于乙酸乙酯萃取物中。DBR-5乙酸乙酯萃取物对10种植物病原真菌的抑制活性明显高于DBR-3的活性。

表3 两株内生真菌不同溶剂萃取物对10种植物病原真菌菌丝生长的抑制活性

2.4 两株内生真菌乙酸乙酯萃取物对10种植物病原真菌菌丝的毒力

为进一步明确两株内生真菌乙酸乙酯萃取物的抑菌效果，测定其乙酸乙酯萃取物对10种植物病原真菌菌丝的毒力，结果见表4。由表4可知，DBR-3乙酸乙酯萃取物对玉米大斑病菌的毒力最高，EC50为0.3437 g/L，对甘蓝黑斑病菌的毒力最低，EC50为 7.7094 g/L，对其余8种植物病原真菌的EC50值为0.9983～5.4507 g/L。DBR-5乙酸乙酯萃取物对茶伦斑病菌的毒力最低，对玉米大斑病菌的毒力最高，EC50值分别为 0.6112 g/L 和0.0124 g/L，对其余8种植物病原真菌的EC50值为0.0200～0.5989 g/L。DBR-5乙酸乙酯萃取物对10种植物病原真菌的毒力明显高于DBR-3的毒力。

表4 两株内生真菌乙酸乙酯萃取物对10种植物病原真菌菌丝的毒力

3 　讨论

近年来，人们对植物内生真菌白壳属和黑孢霉属做了一些研究工作，发现具有较好的生物活性，如阮丽军［12］从白壳属菌株的发酵液中分离出的3个化合物对肿瘤细胞有较明显的抑制作用，李丽等［13］从核桃叶分离出黑孢霉属Y4 菌株对供试的8种供试病原菌抑制率均大于60%。前人对黑孢霉属真菌的研究较多，目前已分离获得一系列具有抗菌、抗肿瘤等活性的化合物［14-16］。表明该两属植物内生真菌有较广泛的生物活性。本研究从广西地不容快根中分离出的两株内生真菌DBR-3 和DBR-5分别属于白壳属和黑孢霉属真菌，对其发酵产物的抑菌活性研究显示，发酵产物的乙酸乙酯萃取物对供试菌有不同程度的抑菌作用，DBR-3对动物病原菌和植物病原真菌均有抑制活性，抑菌谱广，而DBR-5对植物病原真菌的抑菌活性高。表明两株广西地不容内生真菌在抑菌剂领域有潜在的开发应用前景。至于两株内生真菌的抑菌活性物质，还有待进一步研究。

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［3］Sappapan R，Sommit D，Ngamrojanavanchi N，etal.11-Hydroxymonocerin from the Plant Endophytic Fungus Exserohilum rostratum［J］.J Nat prod，2008，71（9）：1657-1659.

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（责任编辑 杨贤智）

Study on the inhibitory activity of two endophytic fungi of Stephania kwangsiensis Lo.

ZHOU Qiu-yan，QING Zhen，LUO Hai-yu，ZHOU Xian-qing，CHI Tong-hai，DENG Ye-cheng
（Key Laboratory of Ecology of Rare and Endangered Species and Environmental Protection，Ministry of Education of China/College of Life Science，Guangxi Normal University，Guilin 541004，China）

DBR-3 and DBR-5 were two endophytic fungal strains isolated from the root tubers of Stephania kwangsiensis Lo..They were identified as Albonectria rigidiuscula and Nigrospora sp..15 animal pathogens and 10 plant pathogenic fungi were used as indicators to conduct the microbial inhibition experiment of the two endophytic fungi.The results showed that DBR-3 presented inhibitory activity against the tested animal pathogens and plant pathogenic fungi.The MIC values of acetyl acetate extract from DBR-3 fermentation product against the 12 tested animal pathogens were 0.625-10 g/L，and the EC50values to the 10 tested plant pathogenic fungi were 0.3437-7.7094 g/L.DBR-5 had high inhibitory activity against the tested plant pathogenic fungi，but low inhibitory activity against the tested animal pathogens.The EC50values of acetyl acetate extract from DBR-5 fermentation product to the 10 tested plant pathogenic fungi were 0.0124-0.6112 g/L.

Stephania kwangsiensis Lo.； endophytic fungi； inhibitory activity

S482.2+92

A

1004-874X（2016）04-0111-06

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.04.022

2015-10-08

广西自然科学基金（2013GXNSFA A019058）；广西高校科研项目（2013YB037）

周秋艳（1988-），女，在读硕士生，E-mail：393095358@qq.com

邓业成（1965-），男，博士，教授，E-mail：dyecheng@163.com