牦牛和柴达木黄牛的颈动脉体Ⅰ型细胞线粒体和电子致密核心囊泡的体视学比较

常　兰，张　寿*，雷乃虎，2，尚果玛

(1.青海大学农牧学院，西宁 810016；2.青海省天峻县畜牧兽医工作站，天峻 817200)



牦牛和柴达木黄牛的颈动脉体Ⅰ型细胞线粒体和电子致密核心囊泡的体视学比较

常兰1，张寿1*，雷乃虎1，2，尚果玛1

(1.青海大学农牧学院，西宁 810016；2.青海省天峻县畜牧兽医工作站，天峻 817200)

摘要：作者旨在比较牦牛和柴达木黄牛颈动脉体(CB) Ⅰ型细胞线粒体和电子致密核心囊泡(EDCV)的体视学特征。选择海拔3 200 m地区健康成年牦牛和柴达木黄牛各5头，采用透射电镜技术观察CB的超微结构，并运用立体定量方法比较牦牛和柴达木黄牛颈动脉体Ⅰ型细胞线粒体和EDCV的体密度(Vν)、面密度(Sν)、面数密度(NA)、比表面(δ)。结果表明，牦牛和柴达木黄牛的颈动脉体实质细胞主要由Ⅰ型细胞和Ⅱ型细胞组成，颈动脉体Ⅰ型细胞细胞质中含有大量的线粒体和特征性的电子致密核心囊泡。牦牛Ⅰ型细胞线粒体的Vν值大于柴达木黄牛，但差异不显著(P>0.05)；牦牛Sv、NA、δ值均小于柴达木黄牛，其中Sν、δ值在两组间差异均不显著(P>0.05)，NA在两组间差异显著(P<0.05)；牦牛Ⅰ型细胞质内EDCV的Vν值小于柴达木黄牛(P>0.05)；牦牛Sν、NA和δ值均大于柴达木黄牛(P>0.05)。结果提示这种结构特征可能使牦牛对环境低氧的感知比生活在相同海拔高度的柴达木黄牛迟钝。

关键词：线粒体；电子致密核心囊泡；颈动脉体；牦牛；柴达木黄牛；体视学

颈动脉体(carotid body，CB)是主要的外周化学感受器，位于颈总动脉分叉处、血管壁外周的结缔组织中，其功能主要是感受动脉血氧分压(PaO2)、二氧化碳分压(PaCO2)和pH的变化，从而调节呼吸和循环反射。颈动脉体实质细胞包括两种特殊类型的细胞：Ⅰ型细胞(或称主细胞、球细胞)和Ⅱ型细胞(或称支持细胞、卫星细胞)。Ⅰ型细胞细胞质中除线粒体、溶酶体、内质网等细胞器外还具有许多特有的电子致密核心囊泡(electron dense-cored vesicles，EDCV)，已知这些囊泡内含儿茶酚胺、乙酰胆碱、脑啡肽、P物质等多种神经化学物质。有关CB方面的研究主要集中在人[1]、大鼠[2]、小鼠[3，4]、兔[5]和绵羊[6]上，而对生活在青藏高原高寒低氧生态环境下牦牛和柴达木黄牛CB的比较研究未见有报道。为此，作者对生活在相同海拔(海拔3 200 m)下的牦牛和柴达木黄牛的CB电镜结构进行了比较研究。

1材料与方法

1.1材料

选取生活在青海省海西州(海拔3 200 m)成年健康牦牛和柴达木黄牛各5头，经颈动脉放血处死后立即取两侧颈动脉体，一侧颈动脉体取1 mm×1 mm×2 mm大小组织投入冷2.5%戊二醛固定液中用于透射电镜制样(另一侧颈动脉体置入4%多聚甲醛磷酸缓冲液中固定48 h，用于光镜制样)。

1.2透射电镜制样

取2.5%戊二醛固定液中的颈动脉体组织，0.1 mol·L-1PB漂洗后，1%锇酸固定2 h，丙酮梯度脱水，环氧树脂618包埋，每头做2个包埋块，超薄切片，进行醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，用日本产H-7650型透射电镜在放大3 000倍、20 000倍、30 000倍和50 000倍下数码照相观察超微结构，在放大20 000倍下每头牛颈动脉体组织拍摄7～10个视野，每组40张数码照片用于体视学分析。

1.3立体定量分析方法

参照E.R.Weibel[7]和郑富盛[8]正方测试格点计数法，绘制用于电镜照片的电子方格测量系统，用点计数法在电镜照片上计数落入参照系的测试点数(Pr)，参照系内待测结构(线粒体、电子致密核心囊泡)的数目(Nx)、待测结构内的测试点数(Px)、待测结构的边界与测试线的交点数(Ix)，按立体学公式计算出待测结构的体密度(volume density，Vν；单位体积Ⅰ型细胞质中线粒体、EDCV的体积百分比)、面密度(surface density，Sν；单位体积Ⅰ型细胞质中线粒体、EDCV外膜的表面积)、面数密度(numerical density on area，NA；单位面积中线粒体、EDCV数目)、比表面(specific surface，δ；线粒体、EDCV表面积与其自身体积之比)各结构参数。

1.4统计学处理

2结果

2.1牦牛和柴达木黄牛颈动脉体Ⅰ型细胞线粒体和EDCV电镜观察

牦牛和柴达木黄牛的颈动脉体实质细胞主要由Ⅰ型细胞和Ⅱ型细胞组成。Ⅰ型细胞数量多，较大，呈圆形，细胞核也呈圆形(图1A、B)，Ⅱ型细胞分布于Ⅰ型细胞的周围，细胞小而少，胞体较扁，细胞核呈三角形、卵圆形或梭形的，并略向Ⅰ型细胞弯曲。Ⅰ型细胞的细胞质中含有大量的线粒体和特征性的电子致密核心囊泡(图1C、D)。颈动脉体Ⅰ型细胞的线粒体形态有圆形、椭圆形、棒状等，线粒体结构完整，牦牛颈动脉体Ⅰ型细胞中的线粒体数量比柴达木黄牛的相对少、体积相对大；EDCV 绝大部分呈圆形，少数呈卵圆形或短棒状，有深、浅两种致密颗粒，大小不一。它们包含有一个中心致密的嗜锇核，呈圆形，周围有电子密度低的空晕，其周围有一层限界膜(图1E、F)，牦牛颈动脉体Ⅰ型细胞中EDCV数量比柴达木黄牛的相对多、体积相对小(图1C、D)。

2.2牦牛和柴达木黄牛颈动脉体Ⅰ型细胞线粒体体视学参数比较

A、C、E、F.牦牛；B、D.柴达木黄牛；A、B.3 000×；C、D.20 000×；E.30 000×；F.50 000×；△.Ⅰ型细胞；☆.Ⅰ型细胞核；.电子致密核心囊泡；.线粒体A，C，E，F.Yak；B，D.Qaidam yellow cattle;A，B.3 000×；C，D.20 000×；E.30 000×；F.50 000×；△.Type Ⅰ cell；☆.Necleus of type Ⅰ cell;.EDCV;.Mitochondria图1　牦牛和柴达木黄牛颈动脉体Ⅰ型细胞线粒体和电子致密核心囊泡透射电镜图Fig.1　Type Ⅰ cells mitochondria and EDCV in carotid body of yak and Qaidam yellow cattle

表1可知，牦牛颈动脉体Ⅰ型细胞线粒体的Vν值大于柴达木黄牛，但差异不显著(P>0.05)；Sν、NA、δ值均小于柴达木黄牛，其中Sν、δ值在两组间差异均不显著(P>0.05)，NA在两组间差异显著(P<0.05)。

表1　牦牛和柴达木黄牛颈动脉体Ⅰ型细胞线粒体参数的比较±s)

同一列中，标有*表示差异显著(P<0.05)，下同

Values with * mean signifiant difference (P<0.05) in the same column，the same as below

2.3牦牛和柴达木黄牛颈动脉体Ⅰ型细胞EDCV体视学参数比较

由表2可以看出，牦牛颈动脉体Ⅰ型细胞质内EDCV的Vν值小于柴达木黄牛(P>0.05)；Sν、NA和δ值均略大于柴达木黄牛(P>0.05)，表明牦牛颈动脉体中Ⅰ型细胞质内EDCV的数量多于柴达木黄牛、体积小于柴达木黄牛，但差异均不明显(P>0.05)。

表2　牦牛和柴达木黄牛颈动脉体Ⅰ型细胞内EDCV体视学参数比较±s)

3讨论

3.1牦牛和柴达木黄牛颈动脉体Ⅰ型细胞线粒体的比较及其意义

颈动脉体是机体重要的外周化学感受器，能够瞬间感知体内PaO2的变化，释放神经递质，产生神经冲动，通过颈动脉体窦神经传入至中枢神经系统，引起机体对低氧的应答[9]，同时在慢性低氧中能自发的适应和调节，包括形态方面的改变[10]。颈动脉体Ⅰ型细胞被认为是氧感知细胞，但目前对于CB在慢性低氧中的调节机制并未得到系统性的阐明。“线粒体假说”认为氧分压的直接感受器是Ⅰ型细胞中线粒体呼吸链末期的细胞色素氧化酶，线粒体通过氧化磷酸化的呼吸作用，介导颈动脉体对低氧分压的反应[11]；而“能量代谢假说”认为颈动脉体Ⅰ型细胞通过线粒体能量代谢的变化感受氧，低氧抑制线粒体电子传递，导致细胞质Mg-ATP下降，使细胞膜氧敏感TASK样钾离子通道抑制[12-13]；另一种能量代谢假说“AMP酶假说”提出腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK) 调节不同的钾离子通道(包括TASK通道)，AMPK是细胞内能量感受器，缺氧导致细胞内ATP不足时，AMP /ATP 值增高，AMP激活位于细胞膜上的 AMPK，进而抑制细胞膜钾离子通道，引起细胞去极化和钙离子内流以及窦神经的兴奋[14]。

大鼠在出生前后慢性富氧引起CB永久性的萎缩和细胞功能的改变[15]，而慢性低氧可严重损害出生后CB细胞水平的氧敏感性。生活在海拔3 300 m的喜马拉雅旱獭和高原鼠兔颈动脉体线粒体未见有缺氧损害[16]。高原人颈动脉体与平原人相比，部分线粒体增大、线粒体嵴并不减少[17]。本试验结果表明牦牛和柴达木黄牛颈动脉体Ⅰ型细胞含有大量线粒体，结构完整，这与高原世居动物——喜马拉雅旱獭和高原鼠兔[16]、高原人[17]的研究结果基本一致。本研究发现牦牛CB的Ⅰ型细胞线粒体比生活在同一海拔的柴达木黄牛数量明显少，有文献报道在光镜水平暗细胞显著增加反映CB对低氧反应表现为较高的功能活动[18]，作者先前的研究也发现生活在同一海拔的牦牛CB暗细胞与柴达木黄牛的数量差异不显著 (另文发表)。分析其原因这可能与牦牛和柴达木黄牛的适宜的生活环境有关，根据牦牛的生活习性，海拔3 000～5 000 m是它的最为适宜范围，而本试验海拔为3 200 m，此海拔高度对牦牛而言是处于相对较低范围，氧的供给相对充足，因而牦牛CB处在相对较低的功能状态，这就表现为与氧感受、调节有关的Ⅰ型细胞线粒体数量明显少；而对于适宜当地气候条件的地方培育品种——柴达木黄牛而言，适宜生活海拔在2 800～3 200 m，试验海拔3 200 m是相对较高的海拔范围，使它处于低氧刺激高度，CB相对处在较高的功能状态，表现出Ⅰ型细胞线粒体数量显著多于牦牛的现象。另外，牦牛和柴达木黄牛Ⅰ型细胞线粒体数量的差别是否与低氧通气反应钝化有关将有待于进一步研究。

3.2牦牛和柴达木黄牛颈动脉体Ⅰ型细胞EDCV的比较及其意义

颈动脉体Ⅰ型细胞为神经分泌细胞，其细胞质内电子致密核心囊泡是具有调节心血管及呼吸功能的神经分泌颗粒，嗜锇核是生物胺(如儿茶酚胺类的去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、多巴、5-羟色胺等)的主要分泌源。E.M.Abdel-Magied等[19]对山羊的超微结构观察发现，山羊CB的Ⅰ型细胞中含有数量、大小不一的EDCV；陈钦铭等[16]对喜马拉雅旱獭与高原鼠兔的颈动脉体超微结构进行观察，发现旱獭颈动脉体Ⅰ型细胞中的EDCV呈多形性，细胞核较不规则，多呈分叶状，而高原鼠兔则多为圆形，细胞核比较规则，多呈球形。本研究结果显示牦牛和柴达木黄牛颈动脉体Ⅰ型细胞质内EDCV绝大部分呈圆形，少数呈卵圆形或短棒状，数量大小不一，每个EDCV具有一个中心致密的嗜锇核。这一结果与高原鼠兔[16]和山羊[19]上的报道相似。本研究还发现牦牛和柴达木黄牛EDCV均有深、浅两种，这是否与内含的神经活性物质不同有关，有待进一步研究。

当血液中氧分压降低时可以引起颈动脉体球细胞去极化及神经递质的释放[20]，通过颈动脉体窦神经传入至呼吸中枢，引起呼吸加深加快。高原成人颈动脉体内EDCV的体密度和面数密度明显多于平原组[21]。本研究中牦牛CB的Ⅰ型细胞EDCV虽然比生活在同一海拔的柴达木黄牛小而多，但差异不明显。这可能也与前述的牦牛和柴达木黄牛生存的适宜海拔高度有关。在海拔3 200 m时，牦牛呼吸相对平缓，导致颈动脉体Ⅰ型细胞中神经活性物质的合成缓慢、分泌、释放减少，CB处在相对较低的功能状态，EDCV也表现为相对小而多；对于柴达木黄牛而言在海拔3 200 m时，机体处于相对低氧状态，呼吸功能相对增强，持续低氧的刺激下使颈动脉体Ⅰ型细胞中神经活性物质的合成增强，同时其分泌、释放也加快，CB处在相对较高的功能状态，EDCV也表现为较大而少。

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(编辑白永平)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.022

收稿日期：2016-01-06

基金项目：国家自然科学基金(31360590)；青海省科技应用基础项目(2014-ZJ-711)；青海省科技支撑项目(2012-N-537)

作者简介：常兰(1965-)，女，青海互助人，教授，硕士，硕士生导师，主要从事高原动物低氧适应研究，E-mail：changlan0123@163.com *通信作者：张寿，E-mail：qhzhangshou@163.com

中图分类号：S852.16

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)07-1474-06

Stereologic Study on Mitochondria and Electron Dense-cored Vesicles of Carotid Body Type Ⅰ Cells between Yak and Qaidam Yellow Cattle

CHANG Lan1，ZHANG Shou1*，LEI Nai-hu1，2，SHANG Guo-ma1

(1.CollegeofAgricultureandAnimalHusbandary，QinghaiUniversity，Xining810016，China；2.TianjunCountyAmimalHusbandryandVeterinaryStationofQinghai，Tianjun817200，China)

Abstract:The aim of the present study was to compare the stereology characteristics of mitochondria and electron dense-cored vesicles (EDCVs) of carotid body(CB) type Ⅰ cells between yaks and Qaidam yellow cattle.In this study，the ultrastructures of CB in health adult yaks (n=5) and Qaidam yellow cattle (n=5) at altitude of 3 200 m were observed by electron transmission microscopy technique，and the volume density (Vν)，surface density (Sν)，numerical density on area (NA) and specific surface (δ) of mitochondria and EDCV of CB type Ⅰ cells between yaks and Qaidam yellow cattle were compared by stereology.The results showed that the CB parenchyma cells were composed of type Ⅰ cells with many mitochondria and EDCVs in the cytoplasm and type Ⅱ cells in yaks and Qaidam yellow cattle，The Vν of mitochondria of CB type Ⅰ cells in yaks were greater than that of in Qaidam yellow cattle (P>0.05)，the Sν，NA，δ were less than that of in Qaidam yellow cattles，with no significant difference in Sν and δ between yaks and Qaidam yellow cattle (P>0.05) and significant difference in NA between 2 gropes(P<0.05)；The Vν of EDCV of CB type Ⅰ cells in yaks were less than that of in Qaidam yellow cattle (P>0.05)，and the Sν，NA，δ were slightly greater than that of in Qaidam yellow cattle (P>0.05)，respectively.The results suggest that the structure characteristics may make the yak was more insensive to perceive hypoxia environment than the Qaidam yellow cattle.

Key words:mitochondria；electron dense-cored vesicle；carotid body；yak；Qaidam yellow cattle；stereology