3-羟基根皮苷的雌激素样作用及其作用机制研究

武　玲　汪鋆植，2　罗华军　郭东艳　陈北燕　余海立　贺海波，2

(1. 三峡大学 天然产物研究与利用湖北省重点实验室， 湖北 宜昌　443002； 2. 湖北省土家族药物研究所， 湖北 宜昌　443002； 3. 陕西中医药大学药学院， 陕西 咸阳　712046)



3-羟基根皮苷的雌激素样作用及其作用机制研究

武玲1汪鋆植1，2罗华军1郭东艳3陈北燕1余海立1贺海波1，2

(1. 三峡大学 天然产物研究与利用湖北省重点实验室， 湖北 宜昌443002； 2. 湖北省土家族药物研究所， 湖北 宜昌443002； 3. 陕西中医药大学药学院， 陕西 咸阳712046)

摘要：研究了3-羟基根皮苷雌激素作用并初步探讨其发挥作用的可能机制．通过MTT法检测3-羟基根皮苷对MCF-7细胞及MDA-MB-231细胞增殖的影响；小鼠子宫增重实验检测3-羟基根皮苷对子宫、卵巢系数的影响，并用酶联免疫吸附(ELISA)法测定血清中雌二醇(E2)含量，Western blot法检测小鼠子宫组织中雌激素受体(ERs)的表达；计算机辅助药物设计法及酵母双杂交实验检测3-羟基根皮苷与ERs的结合能力．结果表明，与空白组相比，3-羟基根皮苷浓度为6×10-5～3×10-4mol/L可促进MCF-7细胞增殖，对MDA-MB-231细胞增殖无显著影响；3-羟基根皮苷可促进小鼠子宫发育，提高体内E2的含量，对子宫组织中ERα表达有促进作用；计算机模拟3-羟基根皮苷与ERs分子对接及酵母双杂交实验表明3-羟基根皮苷与ERβ有较强结合能力．3-羟基根皮苷具有雌激素样作用，可能通过与ERs结合，并影响雌激素分泌及ERα表达发挥作用．

关键词：3-羟基根皮苷；雌激素；雌激素受体

雌激素(estrogen)是女性体内重要的调节激素之一，雌激素对女性生殖、心血管、骨骼等系统的功能具有重要作用．女性进入围绝经期后，由于卵巢功能衰退，雌激素水平急速下降，出现一系列围绝经期症状．临床多使用雌激素替代疗法(estrogen placement therapy， ERT)缓解围绝经期症状，但长期应用激素替代疗法有增加乳腺癌、子宫内膜癌等肿瘤的发病风险[1-3]．因此，寻求更安全的雌激素替代品成为围绝经期综合证的需要，植物雌激素具有更好的安全性，成为雌激素替代疗法的选择之一[4-6]．其中黄酮类化合物是常见植物雌激素的来源．

前期研究表明土家族常用药湖北海棠具有雌激素样作用，其主要成分黄酮类化合物根皮苷是主要有效成分，具有雌激素双向调节的作用[7]．3-羟基根皮苷是湖北海棠叶中另一主要成分，结构与根皮苷类似，属二氢查尔酮苷．本实验重点研究3-羟基根皮苷的雌激素样作用，为更好地开发利用湖北海棠提供基础．

1材料与仪器

1.1实验动物、细胞株及酵母菌株

SPF级昆明小鼠40只，雌性，出生21 d，体质量9～12 g，由三峡大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(鄂)2011-0012，设施许可证号：SCXK(鄂)2011-0061．人乳腺癌细胞株MCF-7(ER+)，由武汉中国典藏物培养中心提供；人乳腺癌细胞株MDA-MB-231(ER-)(ATCC)，重组人雌激素受体基因片段(hER)及共激活因子GPIP1的双杂交酵母(Y191)，由日本富山大学馈赠．

1.2药物与试剂

MTT、无酚红、DMEM培养基(gibco公司)；L-15干粉培养基(Invitrogen Corporation)；邻硝基苯β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)，17-β-雌二醇(购自sigma公司)；无氨基酵母氮源(Difco)(购自安琪酵母股份有限公司)；雌二醇ELISA试剂盒(Cayman公司)；单克隆ERα、多克隆ERβ抗体(abcam)．3-羟基根皮苷(本实验室提供，纯度98%)．

1.3主要仪器

酶标仪infiniteM200pro(TECAN)，CO2培养箱(SHELLJB)，电泳仪(北京六一生物科技有限公司)，恒温摇床(HDLAPPARATUS)，低温高速离心机(德国eppendof公司)；超净工作台(HDLAPPARATUS)．

2方法

2.1小鼠子宫增重实验

取刚断奶的昆明小鼠9～12 g，共40只．按随机的原则分为5组即空白组、雌二醇组和3-羟基根皮苷高、中、低剂量组，每组8只，每天给药一次，持续5 d．空白组灌胃纯水，雌二醇组灌胃E2悬浊液0.1 mg/kg，3-羟基根皮苷高剂量组80 mg/kg，中剂量组40 mg/kg，低剂量组20 mg/kg，最后一次给药前一天，禁食，不禁水处理12 h后，给药后1 h，称体质量，眼球取血后处死，取子宫、卵巢．称取卵巢、子宫湿重．全血样本自然凝结30 min后，2 000 r/min离心15 min，分离血清，-20℃保存．所取组织包在锡箔纸中，-80℃保存备用．检测指标：①计算子宫系数：子宫(或卵巢)系数(%)=子宫湿重(或卵巢)/体量×100%；②采用ELISA试剂盒检测血清中E2；③利用Western-blot检测子宫组织中ERα、ERβ蛋白表达．根据目的蛋白分子量配10% SDS-PAGE凝胶，调整蛋白量一致，进行电泳．然后常规转膜操作，脱脂牛奶室温封闭1 h．孵育ERα、ERβ抗体(抗体浓度按说明书浓度)，4℃过夜，二抗(1∶5 000稀释)室温轻摇1 h，CEL显色．

2.2MTT法检测细胞增殖情况

2.2.1细胞培养

MCF-7细胞于DMEM培养基(含10%胎牛血清)开放式培养，MDA-MB-231细胞于L-15培养基(含10%小牛血清)中封闭式培养．培养环境：37℃、5%CO2培养箱中．

2.2.2药物分组

3-羟基根皮苷浓度3×10-4、1.5×10-4、6×10-5、3×10-5、1.5×10-5mol/L，E2浓度1×10-9mol/L．

2.2.3MTT法检测细胞增殖实验

MDA-MB-231、MCF-7选取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，加入无血清DMEM吹打成细胞悬液，以1×104/孔的浓度接种于96孔板内，每孔培养液总体积为200 μL．培养24 h待细胞贴壁后，换为含药培养液继续培养，37℃、5%CO2培养4 d后，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)10 μL，37℃、5% CO2继续培养4 h，弃去培养液，每孔加入150 μL DMSO，震荡5～10 min，使结晶物完全溶解．以DMSO调零，用酶标仪在490 nm下测定各孔吸光度值(A490 nm)，计算增殖率[PR(%)=(A490 nm实验组-A490 nm空白组)/A490 nm空白组×100%]．

2.3ERs结合能力的测定

2.3.1重组雌激素受体基因酵母培养

将酵母(Y191)接种于SD/-leu、-try固体培养基，放入培养箱30℃培养．待酵母长好后，挑取单菌落于含10 mLSD/-leu、-try液体培养基的试管中，放入摇床30℃过夜，转化生长．取0.5 mL酵母培养液，于含4.5 mLSD/-leu、-try液体培养基试管中，使溶液在600 nm波长处的吸光度(A)值为0.4．于1.5 mL EP管中加入200 μL新SD/-leu、-try培养基，再加50 μL酵母培养液，加入受试物2.5 μL(不同浓度)继续在摇床上30℃培养4 h．

2.3.2与受体结合情况的测定

取经药物作用4 h的酵母培养液，取150 μL放入96孔板，于600 nm测A值作为酵母密度．将含剩余酵母培养液的EP管放入离心机，12 000 r/min，离心5 min．小心吸取上清液，加入200 μL Z缓冲液(用前加入Zymolyase至终浓度1 mg/mL)，振匀，37℃温育15 min．然后加入40 μL浓度4 mg/ml的2-硝基苯β-D半乳糖苷开始酶促反应，30℃，30 min．之后加入100 μL 1 mol/L Na2CO3停止反应．取150 μL加入96孔板中测定酶活．β-半乳糖苷酶的活性按下式计算：

式中，t为反应时间(min)，v为用于测定的培养液体积(mL)，A600为细胞测定时的密度，A420为2-硝基苯反应完后的吸光度，A550为反应完后的吸光度．

2.4计算机模拟3-羟基根皮苷与ERs分子对接

采用分子对接法计算3-羟基根皮苷与ERs的结合能力，预测雌激素调节作用以及与ERs间的相互作用模式．ERα与ERβ三维结构坐标从Protein Data Bank 下载(PDB Code：3ERD、1U3R)．化合物分子结构构建后采用量子化学半经验算法AM1进行能量最小化．分子对接采用半柔性对接方法GADock(遗传算法分子对接)，设置如下：群规模：50；最大代数：2000；变异概率：0.2000；交叉概率：0.8000；ERα与ERβ的结合位点分别以Glu353和Glu305为中心，盒子大小为25Å×25Å×25Å．

2.5统计学处理

3结果

3.1小鼠子宫增重实验

3.1.13-羟基根皮苷对昆明小鼠子宫、卵巢系数及E2含量的影响

由表1可知．3-羟基根皮苷能促进小鼠子宫发育，提高子宫系数，但与空白组比较，差异无显著性；用3-羟基根皮苷处理后能升高血清E2含量，与空白组比较，高剂量组差异有显著性(P<0.05)，但3-羟基根皮苷对卵巢系数无显著影响．

表1　3-羟基根皮苷对昆明雌性小鼠子宫、卵巢系数及E2含量的影响

注：与空白组比较，**P<0.01

3.1.23-羟基根皮苷对昆明小鼠子宫ERα、ERβ表达的影响

由图1可见，3-羟基根皮苷能促进小鼠子宫ERα表达，且具有浓度依赖性，但差异无显著性；3-羟基根皮苷对ERβ表达无明显影响(与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01)．

图1　3-羟基根皮苷对ERα、ERβ表达的影响

3.23-羟基根皮苷对MCF-7细胞及MDA-MB-231细胞增殖的影响

由表2可知，3-羟基根皮苷对MCF-7细胞有促进增殖的作用，与空白组相比，浓度为6×10-5～3×10-4mol/L对MCF-7细胞增殖差异有显著性，但对MDA-MB-231细胞增殖无明显影响．

表2　3-羟基根皮苷对MCF-7细胞及MDA-MB-231细胞增殖的影响

注：与空白组比较，**P<0.01

3.33-羟基根皮苷与ERs结合能力的影响

由表3可知，雌二醇与雌激素α、β受体有结合能力，3-羟基根皮苷在浓度为10-3mol/L与雌激素α受体的结合能力，与空白组比较差异有显著性(P<0.01)．3-羟基根皮苷在浓度为10-5～10-3mol/L与雌激素β受体有较强的结合能力，与空白组比较，差异有显著性(P<0.01)，且具有剂量依赖性．

表3　3-羟基根皮苷对双杂交酵母系统中β-糖苷酶活性的影响±s，n=6)

注：与空白组比较，**P<0.01

3.4计算机模拟3-羟基根皮苷与ERs分子对接结果

通过分子对接计算得，3-羟基根皮苷与ERα和ERβ的结合自由能分别为-7.32和-7.66 kcal/mol，3-羟基根皮苷与ERβ的亲和力较强．从分子作用模式图3可知，3-羟基根皮苷与ERα受体的Arg352、Tyr328间有氢键作用，而3-羟基根皮苷糖苷上的羟基则与ERβ受体的His308、Ser311、Lys315之间存在较强的氢键作用(A图：3-羟基根皮苷与ERα受体作用模式；B图：3-羟基根皮苷与ERβ受体作用模式)．

图2　3-羟基根皮苷与ERs的分子对接结果

4讨论

体内外实验研究表明，3-羟基根皮苷具有雌激素样作用．作用较E2弱．其雌激素样作用可能通过与ERs结合，进而调控相关基因，从而发挥作用．同时，在体内还可以通过影响雌激素的分泌，从而调节雌激素水平和效应．

3-羟基根皮苷与ERβ受体具有较强结合能力，高剂量时才与ERα具有结合能力．ERα和ERβ可通过不同的信号转导方式调控着细胞中基因的表达，甚至在不同组织中，ERα和ERβ可发挥截然相反的作用．3-羟基根皮苷与不同受体结合能力具有明显差异，与E2具有明显区别．同时，3-羟基根皮苷对ERα表达的影响与E2作用相反，表明3-羟基根皮苷可能具有克服长期应用雌激素替代疗法所致不良反应的应用潜质．Bircan等人[8-9]的研究表明，从正常子宫内膜到子宫内膜癌的进程中，ERα表达逐渐降低，3-羟基根皮苷可以提高ERα表达，可能对子宫内膜癌具有防治作用，但需要进一步研究．

ERs不仅对正常生理功能调控具有重要作用．同时，乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、结肠癌等许多肿瘤发生过程中，ERs也扮演了重要角色．所以，进一步探讨3-羟基根皮苷对不同组织的作用及机制，以及3-羟基根皮苷及根皮苷的相互作用，对更好地利用土家族药物湖北海棠具有重要意义．

参考文献：

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[责任编辑周文凯]

DOI：10.13393/j.cnki.issn.1672-948X.2016.03.024

收稿日期：2016-03-24

基金项目：国家自然科学基金(81202905，31370373)

通信作者：汪鋆植(1966-)，男，教授，博士，主要从事土家族药活性评价和质量控制研究．E-mail：wangjunzhi@ctgu.edu.cn

中图分类号：R284

文献标识码：A

文章编号：1672-948X(2016)03-0108-05

Estrogen Effect and Mechanisms of 3-Hydroxy-Phlorizin

Wu Ling1Wang Junzhi1,2Luo Huajun1Guo Dongyan3Chen Beiyan1Yu Haili1He Haibo1,2

(1. Hubei Key Laboratory of Natural Products Research and Development, China Three Gorges Univ., Yichang 443002, China； 2. Hubei Research Institute of Tujia Medicine, Yichang 443002, China; 3. Shanxi College of Traditional Chinese Medicine, Xianyang 712046, China)

AbstractThis paper investigates the 3-hydroxy Phlorizin estrogen effects and observes its action with different estrogen receptors. The 3-hydroxy Phloridzin effect of cell proliferation on MCF-7 and MDA-MB-231 are measured by MTT assay; mouse uterine weight experiment is conducted to analyze the effect of 3-hydroxy phlorizin on the uterus, ovaries coefficients influence, the determination of serum estradiol by ELISA method; hormone receptor expression detected by Western blot; computer-aided drug design method and the yeast two-hybrid assay 3-hydroxy-root hesperidin and estrogen receptor binding capacity. Compared with the control group, 3-hydroxy-phlorizin concentration of 6×10-5～3×10-4mol/L, the significantly promote the proliferation of MCF-7 cells of MDA-MB-231 cell proliferation is not significant influence; the 3-hydroxy-phlorizin can promote the development of mouse uteras, improve the content of the body estradiol on uterine tissue estrogen receptor α (ERα) expression promoted; computer-aided drug design and yeast two-hybrid experiments show and 3-hydroxy-phlorizin and ERβ have a stronger binding capacity. It is concluded that the 3-hydroxy phlorizin has estrogen effects, and regulating the effects of estrogen secretion and the expression of estrogen receptors by binding to estrogen receptors.

Keywords3-hydroxy phloridzin;estrogen;estrogen receptors