响应曲面法优化夏枯草中迷迭香酸的超声提取工艺

龙　添，楼一层，张　浩

(武汉理工大学 化学化工与生命科学学院，湖北 武汉430070)



响应曲面法优化夏枯草中迷迭香酸的超声提取工艺

龙添，楼一层，张浩

(武汉理工大学 化学化工与生命科学学院，湖北 武汉430070)

[摘要]【目的】 采用响应曲面法建立Box-Behnken模型，优化夏枯草中迷迭香酸的超声提取工艺。【方法】 以料(g)液(mL)比(1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60)、乙醇体积分数(40%，50%，60%，70%，80%，90%)、提取时间(10，20，30，40，50，60 min)为考察因素，迷迭香酸提取率为考察指标，在单因素试验的基础上，采用3因素3水平响应曲面法分析，确定夏枯草中迷迭香酸的最优提取工艺。【结果】 夏枯草中迷迭香酸最佳提取工艺参数为：料(g)液(mL)比1∶28，乙醇体积分数74%，提取时间55 min，在该工艺参数条件下，迷迭香酸提取率达0.52%，与预测值0.54%偏差较小，说明响应曲面法优化超声提取夏枯草中迷迭香酸工艺的参数准确可靠。【结论】 得到了夏枯草中迷迭香酸提取的优化条件，本研究所用方法具有可行性和实用性。

[关键词]夏枯草；超声提取；迷迭香酸；响应曲面法

夏枯草(Prunellavulgaris)又称棒槌草、铁色草、大头花、夏枯头，为唇形科植物，夏枯草的干燥果穗有清火、明目、散结、消肿之功效，用于治疗目赤肿痛、眼珠夜痛、头痛眩晕、瘰疬、瘿瘤、乳房肿痛及甲状腺肿大、淋巴结结核、乳腺增生和高血压[1]。

复方夏枯草为武汉市东湖医院临床应用多年的协定处方药，具有较好的降血压效果，常用于治疗肝阳上亢型高血压[2]。迷迭香酸作为夏枯草中主要活性物质，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗血栓、抑制黄嘌呤氧化酶、保护神经元细胞等作用[3]。因此，对夏枯草中迷迭香酸的提取条件进行优化，可以为夏枯草的进一步利用提供基础。目前，对于夏枯草中迷迭香酸的提取工艺研究，基本都是采用普通正交试验。虽然这种方法也考虑了多种因素的影响，但是不能很好地得出回归模型[4-5]。而曲面优化法(Response surface methodology，RSM)采用多元二次回归方法作为函数估计的工具，可以研究因子与响应值及因子与因子之间的相互关系，是省时省力的一种研究方法[6-7]。

基于此，本研究将响应曲面法应用于夏枯草中迷迭香酸的超声提取工艺优化，在单因素试验基础上，进一步综合分析影响迷迭香酸超声提取率的关键因子，并对其提取工艺进行优化，以确定最优工艺参数，从而提高夏枯草中迷迭香酸的超声提取率。

1材料与方法

1.1材料

夏枯草药材购自安徽亳州中药材公司，经华中科技大学药学院陈家春教授鉴定为正品。

1.2仪器与试剂

Waters 1525 Binary HPLC pump、Waters 2998 photodiode Array Detector(美国waters公司)，AT20型分析天平(十万分之一)、旋转蒸发仪(上海亚荣科技有限公司)，KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

甲醇、乙醇为色谱纯(Tedia公司，美国)，制样所用试剂均为分析纯，液相用水为三蒸水，迷迭香酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111871-201203)。

1.3试验方法

1.3.1色谱条件ZORBAX-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，检测波长330 nm，柱温：30 ℃，流动相：甲醇/体积分数0.5%甲酸溶液(体积比45∶55)，流速：1.0 mL/min，进样量：20 μL。

1.3.2对照品溶液的制备精密称取迷迭香酸对照品5.0 mg于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得每mL含迷迭香酸0.1 mg的对照品溶液。

1.3.3供试品溶液的制备精密称取夏枯草药材粉末1.00 g，加入50 mL体积分数75%乙醇溶液，常温浸泡15 min，采用超声波法进行提取后过滤，收集滤液，再用微孔滤膜(0.45 μm)过滤，即得到夏枯草药材中迷迭香酸供试品溶液。

1.3.4标准曲线的绘制精密吸取对照品溶液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得质量浓度为10,20,40,60,80,100 μg/mL迷迭香酸溶液。用高效液相色谱法测定其峰面积，并以峰面积为纵坐标，迷迭香酸质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得出回归方程为:y=0.380 02x+0.417 31,相关系数r2=0.999 9，迷迭香酸质量浓度在10～100 μg/mL，峰面积与迷迭香酸质量浓度呈良好的线性关系(图1)。

图 1　迷迭香酸对照品质量浓度与峰面积标准曲线Fig.1　Standard curve of mass concentration and peak area of rosemary acid

1.3.5迷迭香酸提取率的测定根据1.3.3节过滤所得滤液的体积(V)，精密量取一定量的滤液进行稀释，根据标准曲线回归方程测定滤液中迷迭香酸的质量浓度(c)，计算迷迭香酸提取率[8]。

式中：c为迷迭香酸质量浓度，n为滤液稀释倍数，V为滤液体积，m为供试夏枯草粉末质量。

1.4迷迭香酸提取的单因素试验

以迷迭香酸提取率为考察指标，取夏枯草粉末6份，每份1.00 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，按1.3.5节中方法进行测定,选择料(g)液(mL)比(x1)、乙醇体积分数(x2)和超声时间(x3)3个因素，考察其对迷迭香酸提取率的影响，确定最佳提取工艺条件。

料(g)液(mL)比分别为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60；乙醇体积分数分别为40%，50%，60%，70%，80%，90%；超声时间为10，20，30，40，50，60 min；固定因素为：料液比1∶30，乙醇体积分数70%，超声时间30 min。

1.5迷迭香酸提取工艺的响应曲面法优化试验

根据Box-Behnken 试验设计原理，在单因素试验基础上，采用3因素3水平响应曲面法，分析并优化夏枯草中迷迭香酸的超声提取工艺。以料液比、乙醇体积分数和超声时间为自变量(表1)，设计17组试验，每次均精密称取1.00 g夏枯草粉末，对提取物进行迷迭香酸含量测定，计算其提取率。

表 1　夏枯草中迷迭香酸提取工艺响应曲面优化的试验方案Table 1　Optimization plan for rosmarinic acid extraction from Prunella vulgaris

2结果与分析

2.1夏枯草中迷迭香酸提取的单因素试验结果

2.1.1料液比的影响图2表明，其他条件不变时，改变提取条件中的料液比，夏枯草迷迭香酸的提取率先呈现上升趋势，当料液比为1∶30时，提取率达最高值；之后随着料液比的增大，迷迭香酸提取率有下降趋势。因此，提取迷迭香酸时料液比为 1∶30 左右较为合适。

图 2　料(g)液(mL)比对夏枯草中迷迭香酸 提取率的影响Fig.2　Effects of solid liquid ratio on extraction rate of rosmarinic acid from Prunella vulgaris

2.1.2乙醇体积分数的影响图3表明，随着乙醇体积分数的增大，夏枯草中迷迭香酸的提取率快速增加，当乙醇体积分数为70%时，提取率达最大值；之后当乙醇体积分数继续增加时，迷迭香酸的提取率反而略有下降。故选取乙醇体积分数为70%左右比较合适。

2.1.3超声时间的影响图4表明，随着超声提取时间的逐渐延长，夏枯草中迷迭香酸的提取率不断增大，当超声提取时间为50 min时，提取率达最大值，随后再延长超声提取时间，迷迭香酸的提取率反而略有下降。故选取超声提取时间为50 min左右较为合适。

图 3　乙醇体积分数对夏枯草中迷迭香酸 提取率的影响Fig.3　Effects of ethanol concentration on extraction rate of rosmarinic acid from Prunella vulgaris

图 4　超声时间对夏枯草中迷迭香酸 提取率的影响Fig.4　Effects of ultrasonic time on extraction rate of rosmarinic acid from Prunella vulgaris

2.2夏枯草中迷迭香酸提取工艺的响应曲面法优化

2.2.1响应曲面优化试验结果根据响应曲面法优化试验设计，超声提取夏枯草中迷迭香酸的提取率结果见表2。

表 2　夏枯草中迷迭香酸提取的响应曲面优化试验结果Table 2　Optimization of rosmarinic acid extraction from Prunella vulgaris by response surface method

表 3　夏枯草中迷迭香酸提取回归方程系数的方差分析Table 3　Optimization of rosmarinic acid extraction from Prunella vulgaris by response surface method

注：“*”表示在0.05水平显著；“**”表示在0.01水平显著。

Note:“*” means significant at 0.05 level;“**” means significant at 0.01 level.

2.2.2响应曲面分析及优化根据二次回归方程绘制响应曲面的三维曲线，得到2个因素交互作用对响应值(迷迭香酸提取率y)的影响，结果见图5-7。

比较图5-7与表3可以看出，各因素对夏枯草迷迭香酸提取率的影响由大到小依次为乙醇体积分数(x2)>提取时间(x3)>料液比(x1)，提取所用的乙醇体积分数对迷迭香酸的提取率具有极显著的影响(P<0.000 1)；而在这3个因素中，乙醇体积分数和提取时间之间的交互作用对响应值的影响比料液比和提取时间及料液比和乙醇体积分数之间的交互作用大，即x2x3>x1x3>x1x2，乙醇体积分数和提取时间之间的交互作用对迷迭香酸的提取率具有显著影响(P<0.05)。

图 5　料液比和乙醇体积分数对夏枯草 迷迭香酸提取率影响的响应曲面图Fig.5　Response surface on effects of material to liquid ratio and ethanol volume fraction on rosmarinic acid extraction rate图 6　料液比和超声提取时间对夏枯草 迷迭香酸提取率影响的响应曲面图Fig.6　Response surface on effects of material to liquid ratio and extraction time on rosmarinic acid extraction rate

图 7乙醇体积分数和超声提取时间对夏枯草迷迭香酸提取率影响的响应曲面图

Fig.7Response surface on effects of volume fraction of ethanol and ultrasonic time on rosmarinic acid extraction rate

2.3验证试验

采用Design-Expert V 8.0.6软件对方程中的响应值(y)进行求解，得到夏枯草中迷迭香酸提取的理论最佳工艺条件为：料液比1∶28.34，乙醇体积分数74.04%，提取时间55.33 min，在此条件下迷迭香酸的提取率可达0.54%。考虑到操作的可行性，将最佳工艺条件修正为：料液比1∶28，乙醇体积分数74%，提取时间55 min，在此条件下进行3次平行试验，测得迷迭香酸的平均提取率为 0.52%，与预测值的相对误差为2.57%，偏差较小，说明响应曲面法优化超声提取夏枯草中迷迭香酸工艺的参数准确可靠，具有实际应用价值。

3结论

本试验在单因素试验基础上，采用响应曲面分析法对超声提取夏枯草中迷迭香酸的工艺进行了优化，得到夏枯草中迷迭香酸的最佳提取工艺条件为：料液比1∶28，乙醇体积分数74%，提取时间55 min，在此条件下夏枯草中迷迭香酸的提取率为0.52%，与预测值(0.54%)偏差较小，可以为实践所用。该工艺为夏枯草的生产和应用提供了依据。

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DOI：网络出版时间:2016-06-0816:2110.13207/j.cnki.jnwafu.2016.07.029

[收稿日期]2014-12-31

[基金项目]国家自然科学基金项目(81173509)；湖北省公益科技研究项目(20121g0186)

[作者简介]龙添(1988-)，男，广东湛江人，在读硕士，主要从事植物药学及中药活性成分研究。 [通信作者]楼一层(1960-)，男，湖北武汉人，教授，主要从事中药活性成分的筛选及制剂研究。

[中图分类号]R284.2

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)07-0209-06

Optimization of ultrasonic-assisted extraction of rosmarinic acid fromPrunellavulgarisby response surface method

LONG Tian,LOU Yiceng，ZHANG Hao

(SchoolofChemicalEngineeringandLifeSciences,WuhanUniversityofTechnology,Wuhan，Hubei430070，China)

Abstract:【Objective】 Ultrasonic-assisted extraction of rosmarinic acid from Prunella vulgaris was optimized using response surface method and Box-Behnken model. 【Method】 Solid liquid ratio (g/mL) (1∶10,1∶20,1∶30,1∶40,1∶50,and 1∶60),ethanol volume fraction (40%,50%,60%,70%,80%,and 90%),and extraction time (10,20,30,40,50,and 60 min) were tested to select optimal extraction conditions for rosmarinic acid from Prunella vulgaris.【Result】 The optimum extraction parameters were:solid liquid ratio 1∶28 (g/mL),ethanol volume fraction 74%,extraction time 55 min,and the extraction rate was 0.52%,which was very close to the predicted value of 0.54%.The surface response optimization of rosmarinic acid ultrasonic extraction from Prunella vulgaris was accurate and reliable.【Conclusion】 Optimal extraction conditions for rosmarinic acid from Prunella vulgaris were obtained and the method was feasible and practical.

Key words:Prunella vulgaris;ultrasonic extraction;rosmarinic acid;response surface method

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160608.1621.058.html