早期胃癌体液中分子标志物研究进展*

2016-08-04孙昌裕邓靖宇梁寒

中国肿瘤临床 2016年13期

孙昌裕　　邓靖宇　　梁寒

·国家基金研究进展综述·

早期胃癌体液中分子标志物研究进展*

孙昌裕邓靖宇梁寒

胃癌发生的机制目前仍未被完全阐明，尽管胃癌的诊断和治疗技术已得到较大程度的提高，但其预后仍然不能让人满意，早诊早治是提高胃癌总生存率的关键，常见的肿瘤标志物在临床应用上却易受限于其敏感性及特异性。随着各种高通量技术的发展，分子标志物的基因组学及蛋白质组学的研究获得突破，为胃癌早期诊治提供了重要基础，其中体液中分子标志物得益于其易获得性逐渐受到关注。本文就近年来的早期胃癌相关体液分子标志物研究进行综述。

胃肿瘤体液基因甲基化蛋白质

恶性肿瘤已成为严重威胁人类健康的疾病之一，胃癌在癌症相关死因中占第3位。胃癌的发生发展是一个多因素、多阶段、多步骤的过程，涉及大量的分子参与和复杂的网络调控。肿瘤分子标志物是指在恶性肿瘤发生发展过程中，由肿瘤细胞的基因表达而合成分泌，或机体对肿瘤反应而异常产生和/或升高的物质，广义上也应包括因肿瘤而导致的不同分子水平的一系列异常改变。这些改变涉及基因及蛋白质等不同水平，有些则是肿瘤发生发展的驱动因素，发现其中的关键分子并确定为胃癌高危预警、早期诊断和有效治疗的生物标志物，对当前胃癌的临床治疗具有重要意义，同时也是攻克胃癌的关键科学问题［1］。近年来，随着技术的革新，越来越多的早期胃癌相关分子标志物被发现，其对于预测疗效、判断预后以及监测治疗反应均有作用。其中，体液中的分子标志物相比于其他来源的标志物具有易获得性的优点，在早期诊断方面有更广阔的前景。

1　早期胃癌常见异常表达的基因水平标志物

1.1DNA甲基化

DNA甲基化为DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下，改变相对应的遗传表现，属于表观遗传学的范畴。DNA甲基化与胚胎发育中的X染色体失活、基因印迹及基因组的结构稳定性等相关，而抑癌基因的启动子甲基化则导致该基因转录失活，在肿瘤研究中检测基因启动子区CpG岛甲基化状态，对于阐明肿瘤发生、发展的机制及建立早期诊断方法均具有重要意义［2］。通过对胃癌相关基因甲基化的分析发现，多种相关基因甲基化是胃癌形成的重要机制之一，在胃癌的发生发展中，许多基因由于CpG岛的异常甲基化而被沉默［3］。研究发现，PAX5、RNF180及PCDH10基因启动子甲基化在胃癌发生中起重要作用，并且与胃癌恶性程度相关［4-6］。Abbaszadegan等［7］通过甲基化特异性PCR（MSP）和免疫组织化学等方法对52例胃癌患者组织中p16基因甲基化及蛋白表达情况进行分析，发现p16基因甲基化与胃癌具有显著相关性。

2　早期胃癌常见异常表达的蛋白质标志物

2.1蛋白质组学分析

蛋白质组学类似于基因组学的概念，指一个基因组、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质的总和。蛋白质组学是后基因组时代研究的一个新领域，通过在蛋白质水平上对细胞或机体基因表达的终产物进行定性和定量的研究，揭示生命活动的过程和规律及基因表达的调控机制。研究技术主要由双向凝胶电泳（2-DE）、质谱（MS）鉴定技术、蛋白质/抗体微阵列（蛋白质/抗体芯片）及生物信息学4部分组成［17］。通过应用蛋白质组学分析发现大量早期胃癌特异性蛋白质。Lu等［18］通过分析胃癌患者血清中的多肽谱峰，发现质荷比为4665的多肽谱峰在Ⅰ/Ⅱ期胃癌与Ⅲ/Ⅳ期胃癌患者中的差异具有统计学意义，特异度和敏感度分别为91.6%和95.4%，预示其可作为早期胃癌的分子指标。Liu等［19］发现6种多肽谱峰，在早期胃癌检测中的特异度和敏感度分别为75% 和100%。Li等［20］发现质荷比为1741～4210的多肽谱峰在胃癌、胃癌前病变与健康对照之间差异最为明显，该研究检出胃癌和癌前病变患者的敏感度为66.7%，特异度为77.3%。以上的研究表明血清蛋白质组学分析对筛选胃癌标志物，尤其是早期胃癌标志物具有重要意义，且这些标志物相比于传统蛋白标志物具有较高的灵敏度和特异度。

2.2芳香族氨基酸

除血清之外胃液中也含有提示胃内早期肿瘤病变的成分。Deng等［21］应用液相色谱法检测胃液中的芳香族氨基酸，结果显示芳香族氨基酸有助于区分早期胃癌与非胃癌患者。酪氨酸、苯丙氨酸及色氨酸诊断早期胃癌的ROC曲线下面积分别为79.0%、83.1%及81.9%，而苯丙氨酸检出早期胃癌的敏感度和特异度分别为75.5%和81.4%。

2.3胃蛋白酶原

目前我国临床上推荐胃蛋白酶原（PG）作为早期胃癌筛查指标。中国早期胃癌筛查及内镜诊治共识意见（2014年）推荐使用PGⅠ浓度≤70 g/L，且PGⅠ/ PGⅡ≤7.0作为高发区胃癌筛查的界值。

2.4颗粒体蛋白

颗粒体蛋白（granulin，GRN）为一种独立的生长因子家族，来源于颗粒蛋白前体的水解，在动物机体组织中广泛存在，调节其生长发育和损伤修复等过程，并在多种癌组织中高表达。Loei等［22］发现GRN在胃癌患者，尤其是早期胃癌患者的血清中表达增高，提示其具有早期诊断价值。

3　早期胃癌细胞水平上的相关检测

3.1幽门螺杆菌检测

幽门螺杆菌（helicobacterpylori，Hp）是一种螺旋形、微厌氧、对生长条件要求十分苛刻的细菌。1983年首次从慢性活动性胃炎患者的胃黏膜活检组织中分离成功，是目前所知能够在人胃中生存的唯一微生物种类。Hp感染导致萎缩性胃炎（chronic atropic gastritis，CAG）、肠上皮化生（intestinal metaplasia，IM）、异型增生等胃黏膜病变，这些病变逐步向肿瘤靠近。Shiotani等［23］对100例行胃镜黏膜剥离（endo⁃scopic mucosal resection，EMR）切除术的早期胃癌患者进行根除Hp治疗，根除组、未根除组和阴性组异时性胃癌的发生率分别为11.1%、9.1%和11.2%，无显著性差异，但根除Hp前对患者进行了胃体小弯萎缩评分，胃癌组全部为重度CAG，与无癌组相比具有显著性差异（P=0.03）。根除Hp可以显著改善胃黏膜CAG和IM，进而降低胃癌的发生。

3.2外泌体检测

外泌体是由多种活细胞分泌到细胞外直径为40～100 nm一种囊泡小体，其内容物含蛋白质、脂质和核酸等。胃癌细胞的外泌体可通过自分泌机制活化PI3K/PKB（又称Akt）和MAPK/ERK信号通路，促进肿瘤细胞的增殖。胃癌细胞能选择性地将Let-7包装到外泌体中，并释放至周围环境中，促进胃癌的恶性进展。Gu等［24］研究发现，胃癌细胞来源的外泌体具有诱导分化的能力，使间质干细胞向肿瘤细胞相关的成纤维细胞分化，这一过程涉及TGF-β/Smad蛋白通路的激活。

3.3循环肿瘤细胞和循环肿瘤

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是由肿瘤组织脱离并进入血液循环系统的肿瘤细胞，是导致肿瘤复发、转移的关键。血液循环中的肿瘤细胞具有原发病灶内的肿瘤细胞学和基因遗传学特征，CTCs及转移病灶中的肿瘤细胞会因坏死和凋亡向外周血释放DNA，即循环肿瘤DNA（ctDNA）。CTCs阳性的胃癌患者远处转移及复发的概率明显增高，而胃癌CTCs高阳性率者较CTCs低阳性率者的预后更差，且生存期更短。Matsusaka等［25］报道，外周血中CTCs数量越多，肿瘤细胞转移的负荷越大，发生转移的可能性也越大。目前有关ctDNA的研究主要集中在DNA甲基化，可能成为早期胃癌诊断的新方向。

4　结语

现代医学的背景下，制约胃癌的治疗效果的因素不再是各种治疗手段，而是胃癌是否能够早诊早治。近年来，随着高通量技术的发展，大量有关分子标志物的研究不断开展，对胃癌的分子病理学有了新的认识。基因组学及蛋白质组学成为胃癌诊断及预后研究的利器，使得胃癌的早期筛查及分层个体化治疗成为可能。高效能的分子标志物在早期诊断，评估远处转移，预测治疗疗效及复发和预后的评估方面能够发挥重要作用。但仍存在一些问题：1）各种分子标志物的表达可能存在个体间的差异，会受到诸如缺氧、感染、细胞毒性药物、耐药性的影响，如何保证一种标志物稳定可靠的表达是首先考虑的问题；2）更为高效、快捷的检测手段必不可少，如DNA甲基化的检测，目前主要手段是甲基化特异性PCR，操作步骤繁琐、时间长、费用高，不适用于大量推广；3）目前发现早期诊断分子标志物的主要方法是首先筛选进展期胃癌与正常组织相比的特有分子改变，现均样本量较小，还需要后续大样本、多中心的研究。总之，针对胃癌早期诊断发现有效分子标志物的工作具有重要的临床意义及广阔的前景。

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（2016-04-19收稿）

（2016-06-22修回）

Investigation progress of molecular biomarkers from body fluids in early gastric cancer

Changyu SUN，Jingyu DENG，Han LIANG
Correspondence to:Han LIANG；E-mail:tjlianghan@126.com
Department of Gastroenterology，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital，National Clinical Research Center for Cancer，Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Tianjin 300060，China
This work was supported by grants from the National Natural Science Foundation of China（No.81572372），and the Application Foundation and Advanced Technology Program of Tianjin Municipal Science and Technology Commission（No.15JCYBJC24800）

The mechanism of gastric cancer（GC）remains unclear.The diagnosis and treatment of GC undergo rapid development，but the prognosis of the patients remains dismal.The key procedure to improve overall survival is early detection and treatment.However，classic tumor markers have several limitations in clinical practice because of their low sensitivity and specificity.Given the expansion of high throughput technologies，investigators have attained considerable progress in obtaining the benefits of molecular biomarkers through genomics and proteomics analysis.These findings provide new directions for the diagnosis and treatment of early-stage GC. Markers from body fluids，which can be easily obtained，are increasingly gaining attention.This article summarizes the progress of the investigation of molecular biomarkers in early GC using body fluids.

stomach，neoplasms，body fluids，genes，methylation，proteins

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.13.443

天津医科大学肿瘤医院胃部肿瘤科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室（天津市300060）
*本文课题受国家自然科学基金项目（编号：81572372）和天津市科委应用基础与前沿技术研究计划项目（编号：15JCYBJC24800）资助

梁寒tjlianghan@126.com

手术标本及各种体液，如外周血浆中均可检测到DNA甲基化异常，为临床应用带来极大便利。因此，肿瘤相关基因启动子甲基化状态是一种非常有前途的生物标记物，可作为肿瘤的敏感性生物标志物。目前已开展应用血浆及胃灌洗液作为标本进行DNA甲基化检测。Zhang等［8］应用MSP法检测胃癌患者和对照者血浆中肿瘤凋亡相关因子SFRP2和RNF180基因启动子区甲基化状态，结果显示两个基因在胃癌患者血浆中的甲基化率显著高于正常健康者，且与肿瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴结转移、远处转移等相关，而联合检测胃癌患者血浆中SFRP2及RNF180甲基化水平优于任一基因单独检测。Oishi等［9］则利用胃灌洗液提取DNA，对128例早期胃癌患者标本，分为内镜治疗前组（64例）及内镜治疗后组（64例），甲基化检测结果证实治疗前组甲基化水平显著高于治疗后组，提示胃灌洗液DNA检测的可行性。

1.2微小RNA

微小RNA（microRNA，miRNA）指18～25个核苷酸长度的非编码RNA序列，由DNA转录而来，但不会被翻译为蛋白质，通过与靶基因mRNA碱基配对降解mRNA或阻碍其翻译，起到靶基因沉默作用。miRNA在肿瘤中根据其作用靶基因不同，可起促进肿瘤生长、转移或抑制作用。miRNA可在血液中检测到，且其特质不会因性别、年龄有所差异［10］。因此，血清/血浆miRNA检测可作为多种肿瘤的新型分子标志物。目前miRNA主要通过即时聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）研究，标本来源包括胃癌组织、血清/血浆及胃液。其中血清/血浆及胃液作为标本意义较大，miRNA包括miRNA21、miRNA25、miRNA27a、miRNA106b、miRNA129、miRNA181c、miRNA191、miRNA199a、miRNA223及miRNA421［11］，均被证实与细胞增殖分化及转移有关，并与肿瘤大小、浸润深度、TNM分期、分化类型等临床病理因素具有一定的相关性。

Cai等［12］报道，血浆miRNA对于早期胃癌的诊断具有一定价值，早期胃癌患者血浆中miRNA106b、miRNA20a和miRNA221明显升高，用于诊断胃癌的ROC曲线下面积分别为77.3%、85.9%和79.6%。Shiotani等［13］分析87例行内镜治疗的早期胃癌患者血清中miRNA含量，结果显示miRNA106b及miR⁃NA21可作为预测胃癌高风险人群的指标。Zhang等［14］发现，胃癌患者胃液中miRNA421明显高于胃内良性病变患者，其ROC曲线下面积为76.7%。以上为较典型的早期诊断标志物研究。

1.3长链非编码RNA

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是真核细胞中一类转录本长度超过200 nt的非编码RNA分子，无或较少有蛋白编码功能，在哺乳动物基因组普遍被转录，也是近年来关注的一种非编码RNA。其与miRNA类似也可在血液及胃液中检测到，可能成为早期诊断胃癌的分子标志物。目前的研究包括lncRNACUDR、lncRNA-HOTAIR、lncRNA-BLACAT1、lncRNACCAT1、lncRNA-GAPLINC、lncRNA-HIF1A-AS2及lncRNA-ABHD11-AS1。其中可作为早期诊断标志物的为lncRNA-CUDR，可在血浆中检测到，且与患者的总生存期具有相关性［15］。另一项研究显示，lncRNAABHD11-AS1水平在早期胃癌患者的胃液中显著升高，结合血清及胃液中CEA检测可提高其准确性［16］。