一测多评法测定银杏叶中3种黄酮类成分的含量

于姗姗　李敏　张秋红

（济南市食品药品检验检测中心，山东 济南 250000）

◆医药快讯◆

一测多评法测定银杏叶中3种黄酮类成分的含量

于姗姗李敏张秋红

（济南市食品药品检验检测中心，山东 济南 250000）

目的：建立测定银杏叶中槲皮素、山柰素、异鼠李素3种黄酮类成分的一测多评法。方法：采用高效液相色谱法（HPLC），以槲皮素为内参物，建立与山柰素和异鼠李素的相对校正因子，计算对应的含量，同时采用外标法测定银杏叶中这3个指标成分的含量，比较计算值与实测值的差异，以验证一测多评法的准确性和可行性。结果：一测多评法的计算值和外标法测定值间无显著差异，实验所得的校正因子可信。结论：一测多评法在银杏叶药材中3种黄酮类成分的含量测定中具有适用性和可行性。

银杏叶；一测多评；高效液相色谱；相对校正因子

银杏又名公孙树，是最古老的植物之一，有裸子植物活化石之称。据《本草纲目》记载，银杏果具有敛肺平喘，止遗尿、白带的作用。自从20世纪60年代开始，很多学者专家对银杏叶做了大量的研究工作，其中涉及银杏叶中含有的化学成分、银杏叶的药理作用和银杏叶的临床应用，研究表明银杏叶中的某些成分对心脑血管疾病等有确切的疗效，因此银杏叶在药品和保健食品的生产上有广泛的应用前景，有的甚至被加工成饮品代茶饮，更扩大了应用。银杏叶化学成分复杂，主要含有黄酮类、萜类内酯类和酚酸类化合物等［1］，《中国药典》2010年版一部银杏叶项下以槲皮素、山柰素、异鼠李素3种黄酮成分作为指标成分，通过高效液相色谱法（HPLC）测定上述 3种黄酮成分的含量，以控制银杏叶的质量。本文将一测多评法运用到银杏叶多种黄酮成分的含量测定中，通过运用槲皮素对照品检测其中一种成分含量，达到对多种成分的考察，以全面控制银杏叶质量。

1仪器与试药

岛津 LC-20AHPLC系统（S），Agilent 1200系列高效液相色谱系统（A）；色谱柱SHIMADZU VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm，2012411）（S），Agilent Zorbax SB-C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm，880975-902）（A），Kromasil 100-5C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm，E84121）（K），Agilent Eclipse Plus C18（50 mm ×4.6 mm，1.8 μm，959941-902）（E）；槲皮素对照品（批号：100081-200406，购自中国食品药品检定研究院）、山柰素对照品（批号：110861-200808，购自中国食品药品检定研究院）、异鼠李素对照品（批号：110860-200608，购自中国食品药品检定研究院）；色谱纯：甲醇、磷酸、纯净水，分析纯：甲醇、盐酸、三氯甲烷等。8批银杏叶样品分别购自漱玉平民大药房、东方大药店、山东博康中药饮片有限公司、老百姓大药房、开心大药店、神农大药房、三九大药店、建联中药店，经鉴定，均为银杏科植物银杏（Ginkgo biloba）L.的干燥叶。

2方法与结果

2.1色谱条件

采用SHIMADZU VP-ODS分析柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；甲醇-0.4%磷酸溶液 （50∶50）为流动相，体积流量1.0 mL/min；检测波长为360 nm；柱温为36℃。在该色谱条件下，各待测成分分离度良好。色谱图见图1。

2.2对照品溶液的制备

分别精密称取槲皮素对照品、山柰素对照品、异鼠李素对照品适量，加甲醇制成每l mL分别含槲皮素59.343 3 μg，山柰素57.166 0 μg，异鼠李素42.510 0 μg的混合溶液，即得。

2.3供试品溶液的制备

取银杏叶中粉约l g，精密称定，置索氏提取器中，依据《中国药典》2010年版银杏叶总黄酮醇苷含量测定项下处理，加三氯甲烷加热回流提取2 h，弃去三氯甲烷液，药渣挥干，加甲醇加热回流提取4 h，提取液蒸干，残渣加甲醇-25%盐酸溶液（4∶1）混合溶液25 mL，加热回流30 min，放冷，转移至50 mL量瓶中，并加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.4线性关系考察

图1对照品和银杏叶样品的HPLC图

取对照品溶液，分别稀释不同倍数，配制成系列质量浓度的混合对照品溶液，分别进样10 μL，以峰面积对各对照品的进样量进行线性回归，结果见表1。表明各对照品的进样量与峰面积之间均呈良好线性关系。

表1　线性关系考察结果

2.5精密度试验

取对照品溶液，连续进样6次，每次 10 μL，计算得槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积的RSD依次为0.42%，0.43%，0.59%。

2.6稳定性试验

取购买于山东博康中药饮片有限公司的银杏叶依法制备的供试品溶液，分别于室温放置0，4，8，12，16，20，24 h进样，计算得槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积的 RSD依次为1.2%，1.1%，1.3%。表明制备好的供试品溶液于室温放置24 h内稳定。

2.7重复性试验

取购买于山东博康中药饮片有限公司的银杏叶6份，每份约1 g，精密称定，制备供试品溶液，依法测定，外标法计算得槲皮素、山柰素、异鼠李素含量的RSD依次为0.9%，1.1%，1.4%。

2.8加样回收试验

取购买于山东博康中药饮片有限公司的银杏叶6份，每份约0.5 g，精密称定，按各成分在药材中的含量不同分别加入适量的对照品，依照“2.3”制备供试品溶液，依法测定，分别计算各对照品的加样回收率。结果槲皮素、山柰素、异鼠李素的平均回收率依次为99.5%，98.2%，96.6%，回收率之间的RSD依次为1.2%，0.8%，1.4%。

2.9不同仪器和色谱柱对相对校正因子的影响

取“2.4”项下配制的系列质量浓度的对照品溶液，各进样10 μL，以槲皮素为内标，分别计算槲皮素对山柰素、异鼠李素的相对校正因子［2］，取平均值。结果见表2。

表2　不同仪器和色谱柱对相对校正因子的影响

2.10色谱峰定位参数的考察

为了在仅采用槲皮素为对照品时，能够确认山柰素和异鼠李素色谱峰的位置，从而通过获得的相对校正因子同时计算3种成分的量，达到一测多评的目的，考察了采用不同仪器和色谱柱时山柰素、异鼠李素色谱峰与槲皮素色谱峰间的相对保留时间之比。结果见表3。结果表明其他待测成分与槲皮素相对保留时间之比的RSD在1.36%～1.67%，可见，与槲皮素色谱峰的相对保留时间之比可作为其他2个待测成分（异鼠李素和山柰素）色谱峰的定位参数。

表3　相对保留时间考察结果

2.11样品测定

取8批银杏叶制备供试品溶液，进样测定，分别采用外标法和一测多评法计算银杏叶中的槲皮素、山柰素和异鼠李素的含量，结果见表4。表明两种方法所得结果无显著差异。

表4　样品测定结果（mg/g）

3讨论

本实验采用HPLC外标法测定并计算了银杏叶中的槲皮素与山柰素、异鼠李素之间的相对校正因子，用相对校正因子计算得到了山柰素、异鼠李素的含量，实现了一测多评。同时，采用外标法测定了银杏叶中的山柰素、异鼠李素的含量，比较了采用外标法测得数值与采用相对校正因子计算所得数值之间的差异。结果表明山柰素与异鼠李素采用相对校正因子计算的含量与采用外标法测定值之间无显著差异。一测多评法在银杏叶的3种黄酮类成分的定量测定中的适用性和可行性得到了验证。

［1］ Van Beek TA，Montoro P.Chemical analysis and quality control of ginkgo biloba leaves［J］.J chromatogr A，2009，1216（11）：2002-2032.

［2］王智民，高慧敏，付雪涛，等.“一测多评”法中药质量评价模式方法学研究［J］.中国中药杂志，2006，31（23）：1925-1928.

Determination of Three Flavonoids Ingredients in Ginkgo with Multi-components by Single-marker

Yu Shanshan，Li Min，Zhang Qiuhong（Jinan Experimental Center for Drug and Food，Shandong Jinan 250000，China）

Objective：A quantitive analysis method of multi-components by single marker（QAMS）was established for the determination of quercetin，kaempferide and isorhamnetin in ginkgo.Methods：Using the HPLC method，with the typical composition quercetin as the indexes，the relative correction factors（RCF）between quercetin kaempferide and isorhamnetin were established to detect the quantitation of quercetin and calculate the corresponding contents.At the same time the external standard method was used for quantitating the three constituents，and compared the difference between calculated values and estimated values，to ensure the accuracy and feasibility of the method apply to ginkgo.Results：Calculated values and estimated values did not make significant difference on QAMS and external standard method.And it showed that the RCF was authentic.Conclusion：QAMS has the applicability and feasibility in the determination of three flavonoids ingredients in Ginkgo.

Ginkgo；QAMS；HPLC；RCF

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.03.008

于姗姗，女，硕士。主要从事中药质量控制与研究。E-mail：yssyb@126.com李敏，女，硕士。主要从事中药质量控制与研究。通讯作者E-mail：568027183@qq.com

2015-12-25）