丛生蛋白在肾远曲小管的表达及其与肾结石关系的初步研究

刘俊江，李守宾，李瑾宜，冯启红，王　刚，魏　东，孙振福，杨　涛，张蕴霞

(1．河北省人民医院泌尿外科， 河北石家庄　050051；2．开滦总医院泌尿外科， 河北唐山　063000；3．西奈山医院， 美国纽约；4．河北省人民医院妇产科， 河北石家庄　050051)



·临床研究·

丛生蛋白在肾远曲小管的表达及其与肾结石关系的初步研究

刘俊江1，李守宾2，李瑾宜3，冯启红2，王刚1，魏东1，孙振福1，杨涛1，张蕴霞4

(1．河北省人民医院泌尿外科， 河北石家庄050051；2．开滦总医院泌尿外科， 河北唐山063000；3．西奈山医院， 美国纽约；4．河北省人民医院妇产科， 河北石家庄050051)

摘要：目的探讨Clusterin在肾脏远曲小管的表达与肾结石的关系。方法用免疫组化方法检测肾结石患者及对照组肾脏组织切片中clusterin表达情况，并作比较分析。结果Clusterin在肾结石组及对照组肾远曲小管均有阳性表达，45例肾结石组患者平均表达强度评分为190.73±80.00，38例对照组为97.76± 63.57，肾结石组表达强度评分明显高于对照组(P<0.001)。结论clusterin表达于肾远曲小管，在肾结石患者中表达明显增强，提示肾远曲小管损伤与肾结石的形成有关。

关键词：肾结石；结石形成；从生蛋白；肾远曲小管；免疫组化

肾结石是泌尿外科最常见的疾病之一，但是泌尿系结石的发生机制仍不十分明确，关于肾结石形成起源部位也存在争议。丛生蛋白(Clusterin)是一种广泛存在于人体组织和体液中的凋亡相关蛋白，参与多种生理过程，在很多肾脏损害模型中表达明显升高，且早于肌酐的变化[1]。肾结石的发生也伴随着肾小管上皮损伤等病理过程，Clusterin是否参与肾结石的发生过程，目前尚无相关研究，为了探讨Clusterin与肾结石发生的关系，我们检测了肾结石患者和非泌尿系结石患者肾组织中Clusterin的表达，并做比较分析。

1资料与方法

1.1临床资料经河北省人民医院伦理委员会讨论同意，选择2013年12月至2014年12月在河北省人民医院泌尿外科接受经皮肾镜手术治疗的肾结石患者45例,年龄23～58岁，平均(42.89±8.49)岁；男性31例，女性14例；在接受手术前，在超声引导下行肾脏组织穿刺活检，活检组织制成石蜡切片。选取在河北省人民医院因外伤行肾切除的患者作为对照组，共38例，年龄21～53岁，平均(40.68±8.68)岁；男性28例，女性10例；所有入选患者需排除恶性肿瘤、高钙血症、高尿酸血症、甲状旁腺功能亢进、痛风、肾小管酸中毒、髓质海绵肾、维生素D中毒等疾病，无肾积水及肾功能异常，无泌尿系感染。两组患者性别比例、年龄无显著性差异(P>0.05)。

1.2实验方法 将4 μm 组织切片进行脱蜡和水化,浸入3%H2O2溶液中，以阻断内源性过氧化物酶的活性，10% 柠檬酸缓冲液中进行抗原修复，Clusterin单克隆抗体在4℃下孵化过夜，三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗涤3次后用辣根过氧化物酶标记的葡聚糖聚合物偶联抗-鼠抗体室温下孵化30 min，3次洗涤后，切片用二氨基联苯胺处理，用苏木精染色。用同一石蜡切块的切片，不用抗体孵化，作为空白对照，用肾细胞癌切片作为阳性对照，胞质深染视为阳性。切片由3位互不知情的病理医师分别检查2次，用高倍显微镜观察，400倍高倍镜下观察至少5个视野，每个区域至少评估500个细胞，阳性细胞数<1%为阴性，阳性细胞≥1%为阳性。表达强度用半定量方法测量：阳性细胞染色强度计分(浅染色计1分,中等染色计2分,深染色计3分)乘以阳性细胞的百分数，用计算机辅助图像分析系统做出评分，取平均值[2]。设定评分<150分为弱表达，评分≥150分为强表达。1.3统计学处理采用SPSS16.0软件进行分析，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，且以P<0.05为有统计学意义。

2结果

2.1Clusterin在肾远曲小管的表达实验结果发现clusterin在肾远曲小管细胞有阳性表达，两组间表达强度不同(图1):结石组强表达率及评分显著高于对照组(P<0.001, 表1)。

图1　Clusterin在肾远曲小管上皮细胞中的表达

2.2性别与Clusterin表达强度的关系病例组织切片Clusterin染色评分男性平均为143.97±82.67，女性为158.50±95.37，性别间无显著性差异(P=0.489)。

表1临床基本资料及两组间clusterin染色评分结果

项目肾结石组对照组t/χ2值P值例数4538年龄(x±s,岁)42.89±8.4940.68±8.68 1.1670.247男性[例(%)]31(68.89)28(73.68)0.2300.631Clusterin染色评分(x±s,分)190.73±80.0097.76±63.575.7840.000clusterin强表达[例(%)]30(66.7)10(35.7)13.4350.000

3讨论

Clusterin是由FRITZ等于1983年鉴定并命名，研究发现Clusterin参与多种重要的生理过程包括细胞凋亡、细胞周期调控、细胞粘附、组织修复等，并与肿瘤的发生和发展关系密切[3]。Clusterin也参与多种肾脏疾病过程，ISHIII等发现在肾积水模型大鼠中Clusterin mRNA水平升高60倍，通过免疫组化检测发现Clusterin表达位于肾远曲小管[4]。JUNG[5]等通过体外细胞实验及单侧肾积水模型研究，发现Clusterin可起到保护肾脏、延缓纤维化的作用，认为Clusterin表达上升是对损伤的一种保护性反应而非导致损伤的原因[5]。多项研究已经证实，Clusterin表达的升高能更灵敏地反应肾脏损伤，且已经被批准作为预测肾脏早期损害的标记物[8]，因此，如果肾组织中Clusterin表达升高，提示存在损伤。

肾结石的发生机制目前尚不清楚，自从RANDALL在1937年发现肾乳头上皮组织下有一种钙化斑块，并称之为Randall斑，Randall斑被很多人认为是肾结石的起源。但是该学说一直存在争议，EVAN等[9]在草酸钙结石患者髓袢细支的上皮基底膜表面发现结晶，并发现有环状蛋白物质沉积。在接受胃肠旁路手术的患者中，集合管起始部尿路上皮间可发现结节状沉积物，而不是Randall斑。说明在结石形成过程中，基底膜及肾小管上皮可能起到重要作用[9-10]。BAGGA等[6]认为高渗透压可能造成肾小管上皮的损伤，暴露基底膜，导致结晶的形成和发展。KHAN[7]认为结晶和细胞的相互作用是结石发生的重要因素，结晶可以导致肾小管上皮的损伤，肾小管的损伤会促进结晶的滞留及在肾乳头表面形成结石。说明肾小管损伤才是结石形成的关键因素。

本研究发现Clusterin在肾远曲小管中表达，与国外文献报道一致，且在肾结石患者中的表达明显增强，证实了肾结石的发生与肾小管细胞的损伤相关，也说明肾远曲小管可能是结石形成的初始部位，为进一步研究肾结石形成机制提供了一定的基础。且由于肾结石患者Clusterin表达明显增强，检测尿液Clusterin的水平有可能可以作为肾结石的早期诊断指标，具有一定的应用前景。

但Clusterin表达的升高是结石形成后损伤肾小管上皮细胞的结果还是参与了结石形成的过程，比如促进结晶与肾小管的粘附，本研究尚不能完全解释，需要进一步的研究。

参考文献：

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[2] LI JY, ZHOU T, GAO X, et al. Testosterone and androgen receptor in human nephrolithiasis[J]. J Urol,2010,184:2360-2363.

[3] SHANNAN B, SEIFERT M, LESKOV K，et al. Challenge and promise:roles for clusterin in pathogenesis, progression and therapy of cancer[J]. Cell Death Differ, 2006,13(1):12.

[4] ISHII A, SAKAI Y, NAKAMURA A .Molecular pathological evaluation of clusterin in a rat model of unilateral ureteral obstruction as a possible biomarker of nephrotoxicity[J]. Toxicol Pathol,2007，35:376-382.

[5] JUNG GS, KIM MK, JUNG YA, et al. Clusterin attenuates the development of renal fibrosis[J]. J Am Soc Nephrol,2012,23:73-85.

[6] BAGGA HS1, CHI T, MILLER J, et al. New insights into the pathogenesis of renal calculi [J].Urol Clin North Am,2013,40:1-12.

[7] KHAN SR. Renal tubular damage/dysfunction: key to the formation of kidney stones[J]. Urol Res,2006,34:86-91.

[8] DAVID ABROTT, SCOTT HADLER, RAMIN ARANI, et al.Characterization of renal biomarkers for use in clinical trials: biomarker evaluation in healthy volunteers[J]. Drug Des, Dev Thera, 2014,8: 227-237.

[9] EVAN AP, COE FL, RITTLING SR, et al. Apatite plaque particles in inner medulla of kidneys of calcium oxalate stone formers: osteopontin localization[J]. Kidney Int,2005,68:145-154.

[10] EVAN AP, BLEDSOE S, WORCESTER EM, et al. Renal inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 3 increases in calcium oxalate stone-forming patients[J]. Kidney Int,2007, 72:1503-1511.

(编辑何宏灵)

收稿日期：2015-05-31修回日期：2015-09-26

基金项目：河北省科技厅指令性计划(No.14277774D)

通讯作者：张蕴霞，主任医师.E-mail：Zhangyunxia67@163.com

作者简介:刘俊江(1967-)，男(汉族)，硕士，主任医师.研究方向：泌尿系结石.E-mail：liujunjiang67@163.com

中图分类号:R692.4

文献标志码:A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.01.007

A preliminary study of the relationship between clusterin expression in renal distal tubule and kidney stone formation

LIU Jun-jiang1, LI Shou-bin2, LI Jin-yi3,FENG Qi-hong2,WANG Gang1, WEI Dong1, SUN Zhen-fu1, YANG Tao1, ZHANG Yun-xia4

(1.Department of Urology, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051,China; 2.Department of Urology, Kailuan General Hospital, Tangshan 063000, China; 3.Mount Sinai Hospital, New York, USA; 4.Department of Obstetrics and Gynecology, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the relation between clusterin expression in renal distal tubule and kidney stones. MethodsThe clusterin expression in renal tissues was detected with immunohistochemical assays in patients with kidney stones and controls. ResultsPositive expressions were detected in both nephrolithiasis group and controls. The mean clusterin score in nephrolithiasis and control samples was 190.73±80.00 and 97.76±63.57, respectively. Patients with kidney stones had a significantly higher mean clusterin score than controls (P<0.001). ConclusionClusterin expression can be detected in renal distal tubule, and the expression intensity in nephrolithiasis group is significantly higher than in controls, which indicates the injury in renal distal tubule is related to kidney stone formation.

KEY WORDS:nephrolithiasis; calculogenesis; clusterin; renal distal tubule; immunohistochemistry