耐药癫痫患者和难治性癫痫大鼠脑组织与外周血GST-π蛋白表达☆

孙志清付庆喜涂丽香车峰远苏全平

耐药癫痫患者和难治性癫痫大鼠脑组织与外周血GST-π蛋白表达☆

孙志清*付庆喜*涂丽香*车峰远*苏全平*

目的 考察耐药癫痫患者和难治性癫痫大鼠脑组织与外周血谷胱甘肽S-转移酶π（glutathione S-transferase π，GST-π）的表达。方法 临床收集2010年1月至2014年3月在我院神经外科行手术治疗的耐药性癫痫患者32例，选择同期因脑血管畸形手术切除的10例正常脑组织为对照；动物试验：收集15只对照组和20只难治性癫痫大鼠组，难治性癫痫依据锂-匹罗卡品癫痫模型制备。检测人与大鼠外周血和脑的GST-π水平表达，并进行组间比较。结果 耐药癫痫患者脑组织的颞叶20例，额叶6例，枕叶6例。GST-π在耐药癫痫患者和难治性癫痫大鼠脑的颞叶、额叶、枕叶中均有表达，存在于细胞胞浆，染成浅黄色至棕黄色颗粒，与对照组比，耐药癫痫患者和难治性癫痫大鼠脑和外周血GST-π表达明显增加（P＜0.05）。结论 GST-π可能参与耐药癫痫的发病，检测外周血GST-π为耐药性癫痫的治疗提供参考。

GST-π耐药癫痫 难治性癫痫大鼠

【Abstract】Objective To investigate the expression of glutathione S-transferase π（Glutathione S-transferase π，GST-π）protein in peripheral blood and brain of patients with drug-resistant epilepsy and refractory epilepsy rats.Methods From January 2010 to March 2014，the expression of GST-π in the blood and brain of 32 cases of drug-resistant epilepsy underwent neurosurgery and 10 cases of cerebral vascular malformation underwent surgery were studied and compared.The expression of GST-π in the blood and brain in refractory epilepsy rats and normal rats were studied and compared.Results The specimen from 20 temporal，6 frontal and 6 occipital lobes were obtained from drug-resistant epilepsy patients.The expression levels of GST-π in the blood and brain in refractory epilepsy rats and normal rats were higher than those of the control groups（P＜0.05）.Conclusion GST-π may be involved in the process of drug-resistant epilepsy. The GST-π expression in blood may be used as a marker for resistance to anti-epileptic agents.

【Key Words】GST-π Protein Drug-Resistant Epilepsy Refractory Epilepsy

癫痫是中枢神经系统常见的发作性疾病，以短暂性、反复性和刻板性为发病特征，临床中超过1/4的癫痫患者发展为耐药性癫痫（drug resistant epilepsy），或称为难治性癫痫（refractory epilepsy），严重影响患者的生活质量［1］。耐药性癫痫成为临床治疗中的难点，耐药性是导致临床上癫痫治疗失败的重要原因，耐药的发生是复杂的生物过程。由于抗癫痫药与肿瘤耐药基因作用的底物相似，肿瘤的耐药基因可能也参与了耐药癫痫。研究显示多药耐药基因的主要表达产物为谷胱甘肽S-转移酶π（glutathione S-transferase π，GST-π）［2］，GST-π是否也参与了耐药性癫痫的形成，如果GST-π参与耐药性癫痫，而一般GST-π往往在病理组织中呈高表达，但组织检测具有处理麻烦，组织难以获得等缺点，GST-π在血液的表达是否也具有参考意义，因此本课题拟考察耐药性癫痫患者脑组织和外周血中GST-π的表达，耐药性癫痫患者与耐药性癫痫大鼠的GST-π是否呈现高表达，这种表达是否在脑与外周血具有同步性，为临床研究耐药性癫痫提供参考信息。

1　研究对象和方法

1.1研究对象

1.1.1临床患者 经院内伦理委员会同意，收集2010年1月至2014年3月在我院神经外科行手术治疗的耐药性癫痫患者32例，男21例，女11例，年龄（25.3±6.4）岁，病程3～15年。阵挛或强直一阵挛性发作15例，复杂部分性发作10例单纯部分性发作7例，所有患者或家属签署知情同意书。纳入标准［3］：①有癫痫发作的典型表现和脑电图特征，经两种以上抗癫痫药正规治疗≥2年，难以控制发作，每个月发作至少3次；②无明显病因，无局灶性神经系统体征；③患者资料完整者。选择同期因脑血管畸形手术切除的10例正常脑组织为对照，男7例，女3例，年龄（23.9±5.8）岁。纳入标准：①无癫痫和热性惊厥史及其家族史；②脑组织检查无组织学异常；③家属签注知情同意书。

1.1.2动物试验 SPF级雄性SD大鼠35只，体重250～300 g，购自山东省实验动物中心，许可证号：SCXK鲁20030004，随机分为2个组别，15只对照组和20只难治性癫痫大鼠组，难治性癫痫依据锂-匹罗卡品癫痫模型制备。

1.1.3难治性癫痫模型制备［4］氯化锂3 mmol/kg腹腔注射后20 h腹腔注射硫酸阿托品1 mg/kg，每隔30 min腹腔注射30 mg/kg盐酸匹罗卡品，直至现癫痫持续状态，当癫痫持续状态可持续60 min，腹腔注射10 mg/kg地西泮，抽搐可缓解或终止，癫痫状态后的大鼠24 h，每天腹腔注射5%的糖盐水，2 次/d，15 d后，采用红外摄像头下集中观察，IV级以上发作成功为癫痫自发发作模型，即难治性癫痫模型，达不到者弃用。

1.2指标检测

1.2.1免疫组化检测脑组织中的GST-π表达脑组织标本取出后置于多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，过氧化氢室温放置15 min，PBS清洗，置于柠檬酸缓冲液121℃高压抗原修复1 min，放置至室温，PBS清洗，山羊血清，室温封闭放置20 min，滴加一抗GSTP1（1：500）4℃孵育过夜，室温放置30 min，PBS清洗，滴加鼠二抗，37℃放置10 min，PBS清洗，加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，37℃放置10 min，DAB显色，镜下观察。

1.2.2血清中GST-π水平 取受试者空腹静脉血3 mL，置于5℃孵育30 min，离心取血清，用ELISA法检测，试剂盒由背景岳泰生物制品有限公司提供。

1.2.3 Western blot检测脑组织中GST-π水平提取50 mg脑组织，加入裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上超声裂解5 s，重复4次，低温离心，收集上清，以紫外分光光度计法定量总蛋白，蛋白定量5 g/ L，每个电泳道上样50 μg，采用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用蛋白质电泳转移仪将产物转移到PVDF膜，脱脂奶粉封闭放置2 h，加入一抗GSTP1：500+GAPDH 1：1000，4℃孵育过夜，TBST洗膜，羊抗鼠二抗（1：5000）室温孵育1.5 h，清洗，以凝胶显像仪和定量软件，以GAPDH条带与电泳条带的灰度面积比值表示GST-π蛋白质的含量。

1.3统计学方法采用SPSS15.0进行统计学分析，计量资料采用x±s表示，计数资料采用例数或百分比表示，组间比较采用组间方差分析或卡方检验，检验水准α=0.05。

2　结果

2.1耐药癫痫患者GST-π在脑内和外周血的表达 收集到耐药癫痫患者脑组织的颞叶20例，额叶6例，枕叶6例。GST-π在人脑的颞叶、额叶、枕叶中均有表达，存在于细胞胞浆，染成浅黄色至棕黄色颗粒，对照组和与耐药癫痫组大脑各区间的GST-π表达无统计学差异（F=1.9，F=2.2，P＞0.05），对照组比，耐药癫痫组GST-π外周血、脑内的表达明显增加（P＜0.05）（见表1和图1）。

表1耐药癫痫患者GST-π在外周血和脑内的表达

图1.耐药癫痫患者GST-π在脑内的表达（200×）注：A：对照组，B：耐药癫痫病组，浅黄色至棕黄色颗粒即是GST-π

2.3难治性癫痫大鼠GST-π在外周血和脑内的表达GST-π在大鼠脑的颞叶、额叶、枕叶中均有表达，存在于细胞胞浆，染成浅黄色至棕黄色颗粒。对照组和与耐药癫痫组大脑各区间的GST-π表达无统计学差异（F=2.5，F=1.5，P＞0.05），与对照组比，难治性癫痫大鼠GST-π外周血、脑内的表达明显增加（P＜0.05）（表2和图2）。

表2难治性癫痫大鼠GST-π在外周血和脑内的表达

图2.对照组与耐药癫痫组脑组织的GST-π蛋白表达的Western blot图 注：C：正常组，N：耐药癫痫组，1：外周血；2：颞叶；3：额叶；4：枕叶

3　讨论

耐药性癫痫是临床中尚未解决，但必须解决的问题，直接影响癫痫患者总体预后。临床较为奇怪的现象是，临床使用的抗癫痫药多为不同化学结构、不同作用机理，但不论对原发或多种病因所引起的继发性癫痫均有不同程度的耐药性［5］。因而，研究耐药性癫痫的发病机制对于开发抗癫痫药具有重要意义。

GST是具有多种生理功能的蛋白质超基因家族，家族间成员的功能相互联系，形成紧密联系的整体，GST-π是该家族的亚型，分子量最小，组织分布广，分布在消化道、呼吸道和泌尿系统上皮等多种组织中，在正常脑组织中一般不表达，但在病变脑组织，如胶质瘤中则表达显著增高［6］。研究显示，当外来有毒有害物进入体内，经I相代谢酶，转化解毒，随后进行与包括GST-π在内的II相代谢酶系统结合，再通过主动/被动转运排出体外。在解毒过程中，GST-π以酶或结合蛋白的形式发挥作用，作为体内重要的生理防线［7］。本课题结果显示，GST-π表达在耐药性癫痫患者和难治性癫痫大鼠的不同脑区间没有明显差异（P＞0.05），在对照组的不同脑区也没有明显差异（P＞0.05），即便硬化的海马区（颞叶）的GST-π表达与脑的其他区域相比无统计学差异，即便MRI结果显示耐药性癫痫患者存在海马区硬化现象，提示GST-π表达与脑区分布可能无关；另外耐药性癫痫患者和难治性癫痫大鼠的脑和血中GST-π表达较正常对照组高，与DENG XUEJUN等［8-11］的研究结果相似。体外实验显示，丙戊酸钠和苯巴比妥钠可诱导培养的胎儿脑神经胶质细胞内GST-π表达增加，存在GST-π表达的神经胶质细胞可降低卡马西平在神经胶质细胞内的药物水平［12］，可见GST-π表达增强可能是抗癫痫药诱导的全身反应。另外，临床中存在相同病因引起同部位的癫痫患者存在不同程度的耐药差异，如与苯妥英钠比，丙戊酸的先天耐药和代谢性耐药发生率均较高，那么GST-π表达增强是否与对药物的易感基因表达有关，或耐药性存在多靶点，再者，GST-π常在消化道、呼吸道和泌尿系统上皮等多种组织表达，本课题结果显示不仅在脑病理检查，而且在外周血中也检测到GST-π，但外周血GST-π水平略低于组织，与DENG X等［13］的研究一致，与刘晶等［14-16］研究认为血清GST-π表达对于食管癌、肺癌和胃癌的药物敏感性具有预测价值的观点相似，笔者认为处于外周血的GST-π应来自病理组织，具有搬运的作用，即携带经代谢酶解毒有毒有害的物质通过血液循环途径排出体外，这也解释了外周血GST-π水平略低于病理组织。可见通过检测癫痫患者外周血GST-π水平判断患者存在耐药，为更改治疗方案提供考，但外周血与中枢GST-π表达的关联性仍需要进一步研究。

匹罗卡品所致癫痫大鼠模型的病理特征与人类颞叶癫痫非常相似，经历急性期、潜伏期、自发性发作而后进入慢性期，近1/2的动物成为难治性癫痫，可见匹罗卡品所致难治性癫痫大鼠模型模型是理想的用于研究人类耐药癫痫的工具［17］。

本课题不足和研究方向有研究认为癫痫病程＞10年患者脑中GST-π的表达较病程＜10年者高［18］，但本课题结果显示GST-π可能参与了耐药性癫痫后期耐药机制，但GST-π表达与病程无关，即病程长和短间的表达无显著差异，可能原因有以下几点：①虽然临床显示病程长者耐药可能性更大，但研究证实多药耐药基因的主要表达产物除了GST-π，还存在P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白和拓朴异构酶基因等都参与了难治性癫痫耐药机制的形成，因此耐药的发生可能与多种蛋白表达异常有关；②体外实验显示诱导脑神经胶质细胞内GST-π表达增加不仅与时间有关也与诱导药物的浓度相关；③可能与纳入样本较少有关。因此进一步的研究除了纳入更多样本，还需要纳入P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白和拓朴异构酶基因进行综合评估。GST-π作为难治性癫痫的研究靶点之一，为难治性癫痫的治疗开辟了新思路：通过下调GST-π可以增强抗癫痫药物的作用。但GST-π底物的多样性和GST-π作为细胞本身的一种防御机制的下调是否会产生潜在的危险，如循环中的毒性物质人脑或细胞自稳机制削弱带来的副作用等尚不清晰。因此，进一步阐明GST-π的调控机制，GST-π与抗癫痫药物的结合及转运机制，是迫切需要解决的问题。

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（责任编辑：李立）

The expression of GST-π protein in peripheral blood and brain of patients with drug-resistant epilepsy and refractory epilepsy rats.

SUN Zhiqing，FU Qingxi，TU Lixiang，CHE Fengyuan，SU Quanping.Shandong Province People's Hospital，Linyi 276003，China.Tel：0539-8077569.

R735.2

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.02.004
☆国家自然科学基金（编号：81301114）
*山东省临沂市人民医院神经内科（临沂276003）

（E-mail：yakev18@163.com）

2014-10-05）