脑胶质瘤环磷腺苷效应元件结合蛋白的表达

郑克彬解靖李艳萌史帅史彦芳

脑胶质瘤环磷腺苷效应元件结合蛋白的表达

郑克彬*解靖△李艳萌△史帅△史彦芳*

目的 探讨环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）在不同级别脑胶质瘤组织中的表达及其临床意义。方法 采用免疫组化法检测CREB在5例颅脑损伤减压术后脑组织切片，55例不同分化程度脑胶质瘤组织切片中的表达，并采用Western blot、RT-PCR检测CREB在10例颅脑损伤减压术后脑组织标本，30例不同分化程度脑胶质瘤组织中的表达。结果 免疫组化法测得CREB的阳性表达率分别为对照组2/5，Ⅰ-Ⅱ级胶质瘤10/15，Ⅲ级胶质瘤11/12，Ⅳ级胶质瘤28/28，免疫组化显示数据总体上有统计学差异（H=28.183，P＜0.05）。RT-PCR法检测2-ΔΔCt值，对照组：1.00±0.00，Ⅰ-Ⅱ级胶质瘤：1.35±0.07，Ⅲ级胶质瘤：2.88±0.11，Ⅳ级胶质瘤：3.75±0.20。脑胶质瘤组织中CREB的表达均高于对照组脑组织，且各级别癌组织间有统计学意义（F=1.208，P＜0.05）。Western blot法测得对照组：0.311±0.014，Ⅰ-Ⅱ级胶质瘤：0.469±0.026，Ⅲ级胶质瘤：0.641±0.028，Ⅳ级胶质瘤：0.896±0.024，各组间有统计学差异（F=1.123，P＜0.05）。结论 CREB在不同分化程度脑胶质瘤组织中均存在过表达现象，与肿瘤的分化程度呈正相关，可能在胶质瘤发生发展过程中起着重要的调节作用。

脑胶质瘤 CREB过表达

【Abstract】Objective To investigate the clinical significance and abnormal expression of the CREB in different grade gliomas.Methods The expression of CREB was examined by using immunohistochemistry in brain tissues from the brain injury（5 cases）and different grade gliomas（55 cases）.The mRNA and protein levels of CREB were further assessed using Western blot and RT-PCR in brain tissues from the patients with brain injury（10 cases）and those with different grade gliomas（30 cases）.Results The positive rates of CREB immunohistochemistry were 2/5 in control，10/15 in Ⅰ-，Ⅱ11/12 inⅢ，28/28 inⅣ.The positive rates of CREB were significantly different among different groups（H= 28.183，P＜0.05）.The mRNA levels of CREB were 1.00±0.000 in control，1.35±0.068 inⅠ-Ⅱ，2.88±0.111 inⅢand 3.75±0.196 inⅣ.The expression of CREB was higher in the glioma than in control group，and the mRNA levels of CREB were significantly different among different groups（F=1.208，P＜0.05）.The protein levels of CREB were 0.311± 0.014 in control，0.469±0.026 inⅠ-Ⅱ，0.641±0.028 inⅢand 0.896±0.024 inⅣ.The protein levels of CREB were significantly different among different groups（F=1.123，P＜0.05）.Conclusion The expression of CREB is elevated in gliomas with different differentiation degrees.The expression of CREB was positively correlated with the degree of differentiation，indicating that CREB may have an important regulatory role in the progress of gliomas.

【Key words】Glioma CREB Over-expression

胶质瘤目前是神经外科领域常见的恶性肿瘤之一，它是发生于神经外胚层，由间质细胞及实质细胞形成的肿瘤。近年来有关资料显示CREB高表达与多种类型肿瘤的发生和发展密切相关。本研究通过免疫组化法（Immunohistochemistry，IHC）、蛋白质印记法（Western blot，WB）和逆转录-聚合酶链反应（RealtimePCR，RT-PCR）的方法在组织水平、基因水平以及蛋白水平探究目的蛋白CREB在不同脑组织的表达情况，并通过统计学分析CREB与脑胶质瘤患者临床病理特征之间的关系，进而了解CREB在脑胶质瘤中的临床意义，并为后续实验研究提供理论依据。

1　对象与方法

1.1研究对象收集2010年1月至2012年12月河北大学附属医院神经外科经病理证实脑胶质瘤患者30例，男18例，女12例，其中Ⅰ-Ⅱ级胶质瘤病例10例，Ⅲ级胶质瘤病例10例，Ⅳ级胶质瘤病例10例，并采取10例颅脑损伤减压术后脑组织作为空白对照，其中男6例，女4例。所选病例年龄25～65岁，平均（53±10）岁。术后标本均储存于-80℃冰箱保存。另在我院病理科采用60例于2010年至2012年手术切除且保存完好的组织病理切片，所有切片均以双盲法经病理医师进行诊断，其中包含5例因颅脑损伤性减压术后的标本作为空白对照，其余为各级别脑胶质瘤病例，标本均在切除术后用生理盐水洗净，10%的福尔马林浸泡固定蛋白，石蜡包埋，保存在4℃冰箱备用。60例标本临床资料完整，其中男31例，女29例，年龄在27～73岁，平均（45±11）岁。其中颅脑损伤减压术后脑组织5例，Ⅰ-Ⅱ级胶质瘤病例15例，Ⅲ级胶质瘤病例12例，Ⅳ级胶质瘤病例28例。以上组织学分析按照WHO（2000）胶质瘤分类标准进行分类。所有患者术前未行放化疗，组织标本均取自大脑皮层，所取标本均已通过患者本人或家属以及医院伦理委员会同意，对照组的一般人口学资料与胶质瘤组无统计学差异。主要试剂与仪器：CREB小鼠单抗及GAPDH兔单抗购自Affinity公司，RNA提取试剂和反转录及PCR试剂盒购自Aidlab公司，PCR扩增仪（Thermo）、Western blot发光仪（C-DiGit）、尼康荧光倒置显微镜（ECLIPSE Ti-S）、酶标仪ELx800（Bio-Tek）。

1.2免疫组织化学SP法检测 将石蜡切片脱蜡，3%甲醇-过氧化氢浸泡，柠檬酸修复液抗原修复，一抗4℃过夜，二抗、三抗各孵育30min，DAB显色，苏木精复染对比，脱水、树胶封片等具体操作步骤按常规进行。所有步骤之间经PBS缓冲液漂洗3×5min，用PBS作为一抗阴性对照。CREB表达主要位于胞浆中，偶有胞核的表达，免疫组化染色后阳性结果呈黄色、棕黄色或棕褐色。在高倍镜（10×20）下，随机选择5个高倍视野，每个视野计数1000个细胞以上，计算肿瘤细胞阳性率：染色细胞＜5%为0分，≥5%～25%为1分，＞25%～50%为2分，＞50%为3分。阳性着色标准为：无色为0分；黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐为3分，以上两种评分相乘，结果3分以下记阴性（-），3分记弱阳性（+），4分以上记强阳性（++）［1］。

1.3蛋白质印迹检测 -80℃冰箱中（术中的新鲜标本）组织加入冰冻的RIPA（蛋白裂解液），研磨，按100：1的比例加入PMSF，冰上操作。然后4℃，12000r/min，10min，离心，-20℃保存备用。常规凝胶电泳，转膜，一抗4℃过夜（CREB 1：500，GAPDH 1：8000），二抗（CREB 1：5000，GAPDH 1：5000）37℃，2h，A、B液暗室发光及荧光影像分析。

1.4RT-PCR检测将标本从-80℃冰箱中取出，按试剂盒说明书，进行RNA的提取，-20℃保存。取1μg的总RNA，按照反转录试剂盒说明书要求进行操作。CREB引物：F 5'-TGCCACATTAGCCCAGGTATC-3'，R 5'-TTCTTCAATCCTTGGCACTCC-3'；GAPDH引物：F5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，R 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'，PCR反应体系采用25μL，每组实验做2个副孔，精确实验结果，然后采用荧光定量PCR仪进行检测。结果参照CREB基因CT值，计算CREB mRNA的相对表达量采用2-ΔΔCt法［2］，同时测定标准PCR扩增效率。

1.6统计学方法 所有数据采用SPSS16.0进行分析，计数资料采用多个独立样本比较的秩和检验，计量资料样本数据以x±s表示，多个样本的比较采用方差分析（ANOVA S-N-K）。检验水准α= 0.05。

2　结果

2.1免疫组化检测CREB在组织中的表达 颅脑损伤减压术后脑组织切片中，CREB的表达量较少，主要位于胞浆中，偶有胞核的表达；在人脑胶质瘤组织切片中，CREB的表达量随着肿瘤级别的不同，表达量有所不同，高级别的肿瘤CREB在胞浆中的表达逐渐上升，表达量随着胶质瘤级别的升高逐渐升高（H=28.183，P＜0.05）。见表1。由免疫组化切片可见，CREB在胶质瘤组织中的表达，明显高于空白对照组脑组织切片，并且随着病理分级的增加，CREB在胶质瘤中的表达量逐渐增高。

表1 CREB在60例人脑组织中免疫组化定性分析

图1 CREB在减压术后脑组织及各个级别胶质瘤中的表达（SP，× 200，标尺=50μm）。A：CREB在颅脑损伤减压术后脑组织中表达的量很少，着色评分为0（0×1）；B：CREB在Ⅰ-Ⅱ级脑胶质瘤组织中的成弱阳性，着色评分为3（1×3）；C：CREB在Ⅲ级脑胶质瘤组织中的成强阳性，着色评分为6（2×3）；D：CREB在Ⅳ级脑胶质瘤组织中的成强阳性，着色评分为9（3×3）

2.2 RT-PCR、Western blot检测CREB在组织蛋白中的表达 CREB在脑胶质瘤组织中的表达与颅脑损伤减压术后脑组织相比有统计学意义（CREB/GAPDHF=1.123，P＜0.05；RT-PCRF=1.208， P＜0.05），都高于对照组的脑组织，且各个级别胶质瘤脑组织之间表达量仍有差异，差异有统计学意义（P＜0.05），随着肿瘤级别的增高，表达量逐渐增大。见表2。

表2　CREB在40例人脑组织中相对定量分析

图2 Western blot法检测CREB在颅脑损伤减压术后脑组织及各个级别胶质瘤中的表达量结果

3　讨论

随着社会生活环境的改变，由于人们身边接触的致癌因素加之遗传因素的影响，脑胶质瘤的发病率逐年提高。作为多种肿瘤中高表达的蛋白，CREB可以与CRE基因特异性结合，结合后CRE的下游基因转录活性会大大提高，并且它可以通过cAMP信号通路、Ca2+-CaMK、RAS/ERK、PI3K/AKt等多种磷酸化信号通路实现调节转录的功能［3，4］。CREB的这种活性在肿瘤细胞的发生和发展中具有重要的作用。

本次实验我们发现，CREB在人脑胶质瘤中也存在高表达的现象。CREB的异常表达与人脑胶质瘤的进展密切相关。我们的通过免疫组化法的结果发现，CREB在胶质瘤中的表达量明显高于取自颅脑损伤减压术的脑组织，且随着IHC评分的增高，肿瘤的级别也在升高，说明CREB表达水平的上调与脑胶质瘤的恶性程度有关，肿瘤恶性程度越高，CREB的相对表达量也就越高，提示CREB参与肿瘤的进展。为了进一步验证，我们进行了以下基因及蛋白水平的实验。研究结果发现原癌基因CREB mRNA表达水平在胶质瘤组织中上调，致使胶质瘤组织中CREB蛋白过表达，CREB蛋白和mRNA表达上调可能参与肿瘤细胞中下游基因的活化、细胞凋亡、癌细胞的周期运转等作用，进而促进癌细胞的恶性转化。我们还发现CREB的表达水平与肿瘤的恶性程度密切相关，恶性程度越高的胶质瘤组织中的CREB表达量也就越高。本研究结果显示：Ⅰ-Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级胶质瘤组织中CREB蛋白的表达水平随肿瘤级别的升高而上升。我们进一步通过RT-PCR检测发现CREB mRNA的相对表达量也随肿瘤级别的升高而上升，组间比较仍有统计学意义（P＜0.05），上述结果表明CREB在诱导胶质瘤细胞增值、分化过程中起着重要作用。我们在查阅CREB相关文献中报道CREB在T细胞白血病、卵巢癌、肺癌中的异常表达与癌细胞粘附、浸润与转移密切相关［5-7］。我们的结果以及以往的研究均提示CREB参与了肿瘤的进展。我们之后查阅关于胶质瘤患者生存期的文献，Log-rank统计结果显示单因素分析中病理学分级与胶质瘤患者的生存期呈正相关［8］。通过以上结果我们发现病理分级越高，CREB表达量越高，生存率越低，CREB可能成为早期筛查恶性肿瘤以及生存期评估的最新分子标志物，从而为研发新的抗肿瘤药物提供思路。另外通过本次研究采用的免疫组化法以及半定量WB、RT-PCR法，我们发现由于免疫组化得出的数据为计数资料，结果为我们肉眼评分得出，可能会带有一些主观性，并且没有严格的界限标准，这种计数方法会有许多不确定的结果出现。对于非参数的评分资料，统计方法的选用也相对比较窄，不能采用方差分析以及T检验，多数只能选用秩和检验来分析数据，而且相对于计量资料，计数资料效能也比较低。免疫组化法我们多可以看出目的蛋白在组织内表达的一个大体趋势以及在细胞表达部位等，而对于是否有统计学意义，为了结果的严谨性，通过WB、RT-PCR进一步验证也是有必要的，单独的免疫组化结果则需谨慎对待，并作其他相关检测。

通过以上结果我们推测，当特异性的沉默胶质瘤中CREB的表达会对胶质瘤的生物学行为产生一定影响。之后我们将在U251胶质瘤细胞株中对CREB进行敲低及过表达处理，来深入探讨它的分子作用机制以及对肿瘤细胞的增殖、凋亡和血管生成的影响，为胶质瘤的靶向治疗提供新的依据。

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（责任编辑：甘章平）

The expression of CREB in the Glioma.

ZHENG Kebin，XIE Jing，LI Yanmeng，SHI Shuai，SHI Yanfang.Department of Neurosurgery，Affiliated Hospital of Hebei University，Baoding 071000，China.Tel：0312-5981201.

R739.41

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.02.002
*河北大学附属医院神经外科（保定071000）△河北大学

（E-mail：736490196@qq.com）

2015-09-29）