针刺联合黄芪多糖对db/db小鼠胰岛b细胞Bcl-2蛋白表达的影响

张文奎,李茜,宫翠红,孙志(南京中医药大学,南京 210023)



针刺联合黄芪多糖对db/db小鼠胰岛b细胞Bcl-2蛋白表达的影响

张文奎,李茜,宫翠红,孙志
(南京中医药大学,南京 210023)

【摘要】目的观察针刺联合黄芪多糖对db/db小鼠胰岛b细胞Bcl-2蛋白表达的影响。方法选用自发性2型糖尿病动物模型C57BL/Ksj-db/db小鼠为本实验动物模型。将5周龄db/db小鼠随机分为模型组、针刺组、药物组和针药组,同时将db/m小鼠作为正常组。针刺组大鼠取后三里(相当于足三里)、内庭和胰俞穴予针刺治疗,药物组用黄芪多糖(1400 mg/kg)灌胃,针药组同时给予针刺和药物治疗,均每日1次,连续12星期。实验结束后,采血检测血糖、胰岛素和抵抗素,免疫组化检测胰岛b细胞Bcl-2的蛋白表达。结果在血糖、胰岛素和抵抗素水平方面,针药组、针刺组、药物组显著低于模型组,针药组显著低于针刺组和药物组,针刺组显著低于药物组;在对胰岛b细胞Bcl-2蛋白表达的影响方面,药物组、针刺组及针药组Bcl-2的表达均高于模型组,差异有统计学意义(P＜0.01);针药组Bcl-2的表达高于药物组(P＜0.01);药物组与针刺组Bcl-2的表达基本相同,未见明显差异(P＞0.05)。结论针刺联合黄芪多糖能够显著降低db/db小鼠血糖、血清胰岛素和抵抗素水平,提高胰岛b细胞Bcl-2蛋白的表达水平,从而有效抑制胰岛b细胞的凋亡,作用强于单一针刺治疗和药物治疗。

【关键词】针刺;黄芪多糖;糖尿病,非胰岛素依赖型;b细胞;B淋巴细胞瘤蛋白;小鼠

2型糖尿病的发病率迅速升高,已成为发达国家中继心血管病和肿瘤之后的第三大非传染性疾病。该病常并发心脑血管病、视网膜病变、糖尿病肾病、神经病变和糖尿病足等病症,严重危害人们的身心健康。临床和实验研究表明,针刺联合黄芪多糖治疗2型糖尿病可显著提高疗效[1-2]。2型糖尿病发病核心机制是胰岛b细胞凋亡,Bcl-2(B淋巴细胞瘤蛋白)是重要的抗凋亡蛋白。为进一步探讨针药结合治疗2型糖尿病的机理,笔者进行了本项研究。

1　材料与方法

1.1实验动物

选用自发性 2型糖尿病动物模型 C57BL/Ksj-db/db小鼠为本实验动物模型,由南京大学模式动物研究所提供。4周龄db/db小鼠40只及db/m小鼠(野生型)10只进入实验,均雌雄各半,饲养于南京中医药大学清洁级(SPF)动物中心。每笼5只,雌雄分笼喂养。所有小鼠适应饲养1星期进行分组。

1.2分组及处理方法

40只db/db小鼠随机分为模型组、针刺治疗组(简称为针刺组)、药物治疗组(简称药物组)、针刺和药物结合治疗组(简称针药组),每组10只,同时将db/m小鼠10只作为正常对照组(简称正常组)。

针刺组:将小鼠放入固定器中,用乙醇消毒一侧后三里(相当于足三里)、内庭和胰俞穴,用0.20 mm× 13 mm毫针刺入3 mm左右,行捻转平补平泻手法5次, 接G6805Ⅰ型电针治疗仪(青岛鑫升实业有限公司),强度以动物能耐受为度,连续波和疏密波交替使用,每次治疗15 min。每日治疗1次,连续治疗12星期。

药物组:将黄芪多糖(APS)(由陕西森弗生物技术有限公司提供)用生理盐水配成 12%水溶液,以1400 mg/kg/d黄芪多糖(APS)溶液灌胃,每日1次,持续12星期。

针药组:针刺治疗同针刺组,药物治疗同药物组。

模型组、正常组在针刺组治疗的同时,陪同抓取、固定,并予以等容量生理盐水灌胃,每日1次,均持续12星期。

记录治疗过程中每天的饮水量及摄食量,每星期称重1次。

1.3样本采集

实验第8星期,每间隔3天定时空腹断尾采血测定血糖与血清胰岛素。实验结束后,禁食12 h,次日清晨称重后,10%乌拉坦(氨基甲酸乙酯)1 g/kg腹腔注射麻醉后,摘眼球采血,存于EDAT抗凝管,静置5 min,4000 ×g离心2 min,留取血浆,﹣20℃冻存待检。断颈处死小鼠,剖开腹腔,立即取出胰腺组织,以0.9%冰生理盐水冲洗,用滤纸吸干残留水分,称量组织重量。分别留取标本进行免疫组化及光镜检查。

1.4观察指标与方法

血糖:One TouchⅡ型血糖仪(美国强生公司)和7080型全自动生化分析仪(日本日立公司)检测。

胰岛素:ELISA法检测(苏州卡尔文生物科技有限公司检测)。

抵抗素:ELISA法检测(苏州卡尔文生物科技有限公司检测)。

胰岛b细胞功能指数(Homa-b):Homa-b=20× Fins/(FPG－3.5)。

免疫组化检测Bcl-2蛋白表达:取新鲜胰腺组织,用10%中性缓冲多聚甲醛溶液固定,常规石蜡包埋,连续切取5mm厚的切片,顺次进行HE和免疫组化染色。免疫组化采用抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法,按照试剂盒说明书进行。每片选5个高倍(400倍)阳性视野进行光镜观察,在CMIAS图像分析仪(江苏捷达形态图像分析系统)下记数每个视野中的阳性细胞数和测量分析光镜下Bcl-2的蛋白表达。

1.5统计学方法

运用SPSS11.5统计软件进行统计分析,数据用均数±标准差表示,组间比较用独立样本t检验,多组两两比较用单因素方差分析。

2　结果

2.1各组小鼠体重比较

实验中,因病和操作失误,造成针刺组脱失3只,药物组脱失2只,针药组脱失2只,模型组脱失1只。

治疗前除正常组小鼠外,其余各组小鼠体重无显著性差异(P＞0.05)。治疗后观察体重结果显示,针药组和针刺组体重显著低于模型组,药物组与模型组相比无显著性差异(P=0.147);针药组体重显著高于针刺组(P＜0.05),与药物组相比无明显差异(P＞0.05);针刺组与药物组相比,针刺组体重显著低于药物组(P＜0.05)。详见表1。

表1　各组小鼠体重比较

表1　各组小鼠体重比较　

注:与模型组比较1)P＜0.05;与药物组比较2)P＜0.05;与针刺组比较3)P ＜0.05

组别　n　　治疗前体重　　治疗后体重正常组　10　17.30±2.26　19.67±2.83模型组　9　30.20±2.57　37.00±4.50针刺组　7　28.11±2.57　27.43±1.621)2)药物组　8　29.20±2.35　33.90±4.65针药组　8　29.90±2.03　31.89±4.261)3)

2.2各组小鼠血糖值比较

经过12星期治疗,各组血糖出现明显不同。统计分析显示,针药组、药物组、针刺组均低于模型组(P=0.000),针药组和针刺组显著低于药物组(P=0.000),针药组显著低于针刺组(P=0.000)。同时,针药组血糖又显著高于正常组(P=0.002)。说明针药结合治疗降糖作用最强。详见表2。

表2　各组小鼠血糖比较

表2　各组小鼠血糖比较　

注:与模型组比较1)P＜0.05;与药物组比较2)P＜0.05;与针刺组比较3)P＜0.05;与正常组比较4)P＜0.05

组别　n　　血糖正常组　10　6.13±0.23模型组　9　26.57±0.86针刺组　7　8.17±0.191)2)药物组　8　12.07±0.271)针药组　8　7.02±0.591)2)3)4)

2.3各组小鼠胰岛素比较

各组小鼠血清胰岛素检测结果显示,模型组胰岛素水平显著高于正常组,说明存在高胰岛素血症;针药组、药物组和针刺组显著低于模型组(P=0.000),针药组、针刺组显著低于药物组(P=0.000);针药组显著低于针刺组(P=0.046)。说明针刺、药物和针药结合治疗均能有效改善高胰岛素血症,降低胰岛素抵抗,其中以针药结合治疗的作用最强。详见表3。

2.4各组小鼠抵抗素比较

各组小鼠血清抵抗素结果显示,模型组抵抗素水平显著高于正常组,说明存在胰岛素抵抗;针药组、药物组和针刺组显著低于模型组(P=0.000),针药组、针刺组显著低于药物组(P=0.000);针药组与针刺组相比,针药组又显著低于针刺组(P=0.007)。说明针刺、药物和针药结合治疗均能有效改善胰岛素抵抗,而以针药结合治疗的作用最强。详见表3。

表3　各组小鼠胰岛素、抵抗素比较

表3　各组小鼠胰岛素、抵抗素比较　

注:与模型组比较1)P＜0.05;与药物组比较2)P＜0.05;与针刺组比较3)P＜0.05;与正常组比较4)P＜0.05

组别　n　　胰岛素(mIU/L)　　抵抗素(ng/mL)正常组　10　20.69±0.96　34.68±1.54模型组　9　40.29±1.28　60.85±1.69针刺组　7　20.37±0.921)2)　39.55±1.711)2)药物组　8　36.62±1.561)　50.18±1.671)针药组　8　19.31±0.991)2)3)4)　36.67±1.901)2)3)4)

2.5针刺加黄芪多糖对胰岛b细胞Bcl-2蛋白表达的影响

Bcl-2主要表达部位在胞浆,以黄色及棕黄色染色为阳性表达。正常组Bcl-2表达呈强阳性,其染色的强度及密度均明显高于模型组。模型组Bcl-2表达极低,胰岛内仅见少许散在的细胞胞浆着色呈淡黄色,同正常组比差异显著。各治疗组Bcl-2表达的情况较模型组有不同程度的增加。详见图1。

图1　针刺加黄芪多糖对胰岛b细胞Bcl-2蛋白表达的影响(免疫组化染色,×400倍)

表4　针刺联合黄芪多糖对db/db小鼠Bcl-2蛋白表达的影响

表4　针刺联合黄芪多糖对db/db小鼠Bcl-2蛋白表达的影响

注:与正常组比较1)P＜0.01;与模型组比较2)P＜0.01;与药物组比较3)P ＜0.01

组别　n　Bcl-2表达(平均灰度值)正常组　10　100.99±12.882)模型组　9　140.49±14.431)药物组　7　131.55±17.451)2)针刺组　8　129.79±14.991)2)针药组　8　119.74±6.871)2)3)

对各组Bcl-2蛋白表达的评价用均光密度进行统计分析,由表4和图2可以看出,正常组Bcl-2的蛋白表达高于模型组,差异有统计学意义(P＜0.01);药物组、针刺组及针药组Bcl-2的表达均高于模型组,差异有统计学意义(P＜0.01);针药组Bcl-2的表达高于药物组(P＜0.01);药物组与针刺组Bcl-2的表达基本相同,未见明显差异(P＞0.05)。

图2　各组小鼠治疗后Bcl-2表达平均灰度值比较

3　讨论

db/db小鼠是瘦素(leptin)受体基因缺陷导致的先天肥胖性2型糖尿病小鼠,具有高血糖、高血脂、胰岛素抵抗等特性。db/db小鼠出生后2周内就发生高胰岛素血症,3～4周发展为肥胖,4～8周后就发展为非常严重的高血糖症,其间有胰岛素抵抗发生,胰岛b细胞功能衰竭[3]。其发病过程与人T2DM非常相似,是国际上广为采用的研究T2DM动物模型。本文采用db/db小鼠作为T2DM动物模型,并于已发展到高血糖阶段的6周龄进行干预治疗。

胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷是2型糖尿病发病机制的两个基本环节,核心机制是胰岛b细胞功能障碍,其诱因是代谢综合征相关的胰岛素抵抗导致对胰岛素的长期高需求,其结果是胰岛素相对或绝对不足引起的高血糖及相关慢性并发症[4]。一旦诊断为2型糖尿病,胰岛b细胞功能就已丧失50%。胰岛b细胞功能障碍主要是b细胞数量减少,而b细胞数量减少的重要原因是过量的b细胞凋亡。因此,改善胰岛素抵抗和抑制胰岛b细胞凋亡就成为预防及治愈2型糖尿病的关键。

近年研究显示,针灸治疗2型糖尿病可显著降低空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)及体重,同时可有效改善胰岛素抵抗[5-7]。我们对针灸改善胰岛b细胞功能的作用进行了研究[8-10],结果表明针刺可有效改善胰岛b细胞分泌功能,且具有保护胰岛b细胞形态的作用。

黄芪多糖(PAS)是中药黄芪中主要生物活性成分,具有降低血糖、增加对胰岛素的敏感性、改善胰岛素抵抗、抑制胰岛b细胞凋亡作用,此外还具有提高免疫、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老等生物活性[11]。既然针刺和黄芪多糖对2型糖尿病都有较好的治疗作用,推测二者联合应用可以提高治疗效应,因此进行了本研究。

本文研究显示,模型大鼠血清胰岛素和抵抗素水平均高于正常大鼠,说明存在胰岛素抵抗。针刺和针刺联合黄芪多糖治疗后血清胰岛素和抵抗素水平显著降低,且后者作用更强,说明二者均能有效改善胰岛素抵抗,针刺与黄芪多糖合用具有增效作用。

Bcl-2蛋白家族(B淋巴细胞瘤蛋白家族)抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-xl等)与促凋亡蛋白(如Bax、Bak、Bid等)的异常改变导致线粒体外膜通透性改变,内膜中的细胞色素c(cyt-c)释放入胞质,与凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)和前caspase-9、ATP形成凋亡体(apoptosome)活化 caspase-9,从 而 激 活 效 应caspase-3,6,7导致凋亡。线粒体是细胞主要的供能场所,越来越多的证据表明葡萄糖刺激的胰岛素分泌需要胰岛b细胞具有正常的线粒体功能,线粒体功能失常可能是引起2型糖尿病的重要原因[12]。研究表明,高糖、高脂肪酸(FFA)浓度下均可引起抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl等和促凋亡基因(如Bax、Bak、Bid等)的异常表达。Bcl-2家族成员可通过改变线粒体外膜通透性而调控线粒体活化,在线粒体诱导的凋亡途径中起重要作用。Bcl-2家族不仅存在于线粒体上,也定位于内质网(ER)膜上并影响ER的稳态。内质网应急(ERS)时,未折叠蛋白反应(UPR)的信号分子激活CCAAT增强子结合蛋白(C/EBP)同源蛋白(CHOP)和c-Jun氨基末端激酶(JNK),二者均可削弱Bcl-2的抗凋亡功能,从而诱导Bax和Bak的构象变化并寡聚化最终破坏ER膜的完整性,使ER内的Ca2﹢外流,导致胞质内Ca2﹢浓度升高,最终诱导细胞凋亡。

我们以前的研究表明,针刺可有效抑制2型糖尿病大鼠胰岛b细胞的凋亡[13]。本文研究结果表明,针刺和针刺联合黄芪多糖在有效改善胰岛素抵抗、降低血糖的基础上,均可显著提高胰岛b细胞Bcl-2的蛋白表达,从而有效抑制胰岛b细胞的凋亡。这一作用以针药组最好,提示针刺和黄芪多糖联合治疗有协同作用。这一结果提示,针药结合治疗2型糖尿病具有较大优势。

参考文献

[1]赵亲伟,李茜,孙志,等.针刺联合黄芪多糖对db／db小鼠瘦素和脂联素的影响[J].山东中医药大学学报,2014,(3):275-277.

[2]吴江,徐业.针药联合治疗糖尿病周围神经病变的临床观察[J].中医临床研究,2014,6(35):9-11.

[3]万玉玲,刘晓明.自发性2型糖尿病动物模型[J].医学综述,2008, 14(14):2175-2177.

[4]杨涛.专家专题报告6:中国2型糖尿病患者β细胞功能现状分析[J].中华内分泌代谢杂志,2010,26(10):后插五.

[5]项琼瑶,李国安,沈小珩,等.电针结合耳穴干预单纯性肥胖伴糖调节受损临床研究[J].上海中医药杂志,2013,47(5):31-33.

[6]赵智明,张群燕,赵凌杰,等.针刺对2型糖尿病患者胰岛素敏感的影响[J].山西医科大学学报,2011,42(2):126-129.

[7]王媛,刘志诚,徐斌.电针治疗胃热炽盛型2型糖尿病患者35例临床观察[J].中医杂志,2013,54(10):852-854.

[8]孙志,韩海荣,马丽,等.针灸改善2型糖尿病胰岛b细胞分泌功能的研究[J].中国中医基础医学杂志,2010,16(12):1155-1161.

[9]孙志,马丽,韩海荣,等.针刺提高2型糖尿病模型大鼠胰岛b细胞胰岛素的表达[J].中国组织工程研究,2012,16(28):5227-5231.

[10]庞晓英,孙志.针灸改善胰岛b细胞功能研究进展[J].针灸临床杂志,2014,30(4):75-77.

[11]张晓雷,郭春霞,宋开华,等.黄芪多糖治疗糖尿病及其并发症的实验研究进展[J].中药材,2013,36(2):324-329.

[12]Lowell BB,Shulman GI.Mitochondrial dysfunction and type 2 diabetes[J].Science,2005,307(5708):384-387.

[13]孙志,韩海荣,马丽,等.针灸对2型糖尿病胰岛B细胞凋亡的影响[J].中国老年学杂志,2011,31(6):966-967.

【中图分类号】R2-03

【文献标志码】A

DOI:10.13460/j.issn.1005-0957.2016.06.0738

文章编号:1005-0957(2016)06-0738-04

收稿日期2015-12-20

基金项目:江苏省针灸学重点实验室(针药结合实验室)开放课题(KJA200904)

作者简介:张文奎(1987-),男,2013级硕士生

通信作者:孙志(1962-),男,教授,博士,主要从事针灸治疗内分泌代谢病研究,Email:Sunzhi63@163.com

Effect of Acupuncture plus Astragalus Polysaccharide on the Expression of Bcl-2 Protein in IsletbCells in db/db Mice

ZHANG Wen-kui,LI Qian,GONG Cui-hong,SUN Zhi.
Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210023,China

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of acupuncture plus astragalus polysaccharide on the expression of Bcl-2 protein in pancreatic isletbcells in db/db mice.MethodC57BL/Ksj-db/db mice as an animal model of spontaneous type 2 diabetes were selected for this experiment.Five-week-old db/db mice were randomized into model,acupuncture,medication and acupuncture ＋medication groups.Meanwhile,db/m mice were selected as a normal group.The acupuncture group received acupuncture at points Housanli(equivalent to Zusanli,ST36),Neiting(ST44)and Yishu(Extra)and the medication group,an oral gavage of astragalus polysaccharide(1400 mg/kg).Both groups were treated once daily,for 12 consecutive weeks.After the end of experiment, blood glucose,insulin and resistin were measured,and the expression of Bcl-2 protein in isletbcells was determined by immunohistochemical method.ResultBlood glucose,insulin and resistin levels were significantly lower in the acupuncture ＋medication,acupuncture and medication groups than in the model group.They were significantly lower in the acupuncture ＋medication group than in the acupuncture and medication groups and significantly lower in the acupuncture group than in the medication group.The expression of Bcl-2 protein in isletbcells was higher in the medication,acupuncture and acupuncture ＋medication groups than in the model group;there was a statistically significant difference(P＜0.01).The expression of Bcl-2 protein was higher in the acupuncture＋medication groups than in the medication group(P＜0.01)and it was basically the same in the medication group as in the acupuncture group;there was no statistically significant difference(P＞0.05).Conclusion Acupuncture plus astragalus polysaccharide can significantly reduce blood glucose and serum insulin and resistin levels and increase the expression of Bcl-2 protein in isletbcells to effectively inhibit apoptosis in isletbcells in db/db mice.Its effect is better than that of acupuncture alone or medication.

[Key words]Acupuncture;Astragalus polysaccharide;Diabetes,non-insulin dependent;bcell;B-lymphocyte tumor protein;Mice