针刺对DMBA诱导的乳腺癌大鼠ER、PR表达的影响

曹加伟，黄梅，严晶，徐金龙，杨增荣，黄昆，朱珠，赵荣（云南中医学院，昆明 650000）



·动物实验·

针刺对DMBA诱导的乳腺癌大鼠ER、PR表达的影响

曹加伟，黄梅，严晶，徐金龙，杨增荣，黄昆，朱珠，赵荣
（云南中医学院，昆明 650000）

【摘要】目的 观察针刺足三里、三阴交、膻中对二甲基苯蒽（DMBA）诱导的乳腺癌大鼠乳腺组织中雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）表达的影响。方法 将120只6～8周龄的SD雌性大鼠随机分为模型组90只和空白组30只。模型组采用DMBA进行灌胃造模，空白组给予等剂量的芝麻油灌胃。造模15星期后，将模型组大鼠随机分为治疗组和对照组。治疗组采用针刺足三里、三阴交、膻中治疗，对照组和空白组不采用任何治疗，仅给予相同的抓放。针刺治疗结束后（第27星期），采用电化学发光免疫方法，取腹腔静脉血做血清肿瘤标志物检测；计数肿瘤包块数量并记录形态，取包块组织，用精度为1 mm的游标卡尺测量包块的高度、最大直径和相垂直的直径；采用Olympus光学显微镜下观察肿瘤组织病理学变化及ER、PR的阳性面积及平均光密度。结果 治疗组治疗后乳腺肿瘤平均数目和平均体积与对照组和空白组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。对照组治疗后乳腺肿瘤平均数目和平均体积与空白组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。治疗组和对照组治疗后各项肿瘤标志物（CA724、CA125、CA199、AEP、CA15-3、CEA及CA50）浓度与空白组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。治疗组治疗后CA15-3浓度与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。治疗组治疗后ER、PR阳性面积和平均光密度与对照组和空白组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。对照组治疗后ER、PR阳性面积和平均光密度与空白组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。结论 针刺能够减少DMBA诱导的大鼠乳腺肿瘤的发生（包括肿瘤数目及肿瘤体积的大小），其作用机制可能与降低CA724、CA125、CA199、CA15-3、AEP、CEA、CA50等肿瘤标志物的浓度，尤其是降低CA15-3的浓度，减少ER、PR的阳性面积和平均光密度相关。

【关键词】针刺疗法；乳腺肿瘤；穴，足三里；穴，三阴交；穴，膻中；雌激素受体；孕激素受体；二甲基苯蒽；CA15-3；大鼠

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，是一种严重影响女性身心健康及导致女性死亡的重要病因之一。由于社会因素、饮食结构、不良的作息和生活习惯的改变，全球每年乳腺癌的发生率正以 3%的速度递增，患者群也渐趋年轻化［1］。预计到 2030年，全球乳腺癌的发病人数和死亡人数将分别达到264万和170万［2］。在中国，乳腺癌的发病率已居所有肿瘤疾病的第 2位［3］。研究乳腺癌的有效防治方法具有重大意义。乳腺的生长发育和细胞的增殖分裂主要是受以性激素为中心环节的下丘脑-垂体-卵巢轴的综合调控，该调控作用是通过存在于乳腺上皮细胞内的雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）才能完成的。笔者通过观察针刺足三里、三阴交、膻中对二甲基苯蒽（DMBA）诱导的乳腺癌大鼠乳腺组织中ER、PR表达的影响，探讨针刺防治乳腺癌的作用机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康纯种的SD雌性大鼠120只，6～8周龄，体重为150～200 g，由中国科学院昆明动物研究所提供，为国家A级实验动物。

1.2 实验试剂及仪器

二甲基苯蒽［7，12-Dimethylbenz（a）anthrancene，DMBA，东京化工有限公司生产，产品编号 D0677-3G，GGR4E-GL］，每支1 g，共3支，溶于300 mL芝麻油备用；无水乙醇、10%甲醛、二甲苯、PBS缓冲液、兔抗鼠ER单克隆抗体、兔抗鼠PR单克隆抗体；特制粗针灸针、特制大鼠固定笼、大鼠手术台、灌胃针、一次性注射器、碘伏；Elecsys测量池清洗液预热杯、Elecsys反应杯（瑞士roche公司）、离心机（湖南凯达）、促凝试管（英国BD公司）。

1.3 动物分组与模型制备

将120只雌性SD大鼠按照随机数字表法随机分为模型组90只和空白组30只，模型组用DMBA分两次灌胃，每次灌胃 50 mg/kg，间隔 1星期，总剂量为100 mg/kg，以复制大鼠乳腺癌病变模型；空白组给予等剂量的芝麻油灌胃。造模15星期后，除去检验造模成功的3只、未能诱导出乳腺癌的12只、在造模过程中死亡的21只。再将模型组剩余的大鼠随机分为治疗组和对照组，每组 27只。所有大鼠均按组分笼饲养，饲养条件一致，在室温为（22.00±1.00）℃、湿度为50%～60%的房间饲养，自由摄食，喂以大鼠标准饲料（由中国科学院昆明动物研究所提供），饲料含钙量为（5.66±2.51）mg/g，含磷量为（5.80±1.61）mg/g，昼夜时差控制在12 h：12 h。

1.4 检验造模情况

造模 15星期后，按照随机数字表法从模型组抽取3只大鼠，以光学显微镜检测造模情况，可见模型组大鼠乳腺癌组织呈浸润性生长，实质与间质分界清楚；癌细胞排列失去极性，细胞大小不等，形态各异；核质比例增大；核染色深，核仁大而清楚，可见分泌物及坏死组织，可见病理性核分裂像。

1.5 治疗方法

治疗组采用针刺治疗。取足三里（双）、三阴交（双）、膻中穴。穴位定位根据《实验针灸学实验指导及技能训练》，并参照《实验针灸学》《经络腧穴学》中穴位的定位原则及实验大鼠常用经穴检测与定位方法［4］，以比较解剖和骨度分寸法为依据。将大鼠置于大鼠特制固定笼中，穴位先用碘伏标记，以特制粗针灸针快速刺入皮下，缓慢刺入肌肉，行捻转泻法（即以拇指右转为主27转），留针20 min后起针。每星期治疗3次，4星期为1个疗程，共治疗3个疗程。

对照组和空白组均不做任何治疗，常规饲养，在治疗组治疗的同时，给予相同的抓放。

1.6 观察指标

于治疗结束后（第27星期），对各组大鼠予以腹腔静脉采血5 mL后进行安乐死。将已处死大鼠的颈部至腹股沟备皮后，取下整块腹部皮肤及皮下乳腺组织，进行全面筛查，剔除包块，将包块对半切开进行大体观测，计数包块数量并记录形态，并用精度为1 mm的游标卡尺测量包块的高度、最大直径和相垂直的直径。乳腺肿瘤发生率为该组发生乳腺肿瘤大鼠数与该组大鼠总数之比。肿瘤体积=长×宽×高×π/6［5］。若1只大鼠有多个乳腺肿瘤发生，则该大鼠的乳腺肿瘤体积为每个乳腺肿瘤体积之和。

将从腹腔静脉采集的5 mL血液放置于促凝管内静置30 min后，以3500 r/min离心15 min得血清，用Elecsys电化学发光免疫分析仪检测肿瘤标志物糖链抗原CA724、糖链抗原CA125、糖链抗原CA199、甲胎蛋白（AEP）、糖链抗原CA15-3、癌胚抗原（CEA）、糖类抗原CA50。

取包块组织常规甲醛固定，梯度乙醇脱水后行石蜡包埋切片，切片厚 5 μm。常规 HE染色后，采用Olympus光学显微镜观察肿瘤组织病理学变化，再运用兔抗鼠ER单克隆抗体和PR单克隆抗体在光学显微镜下观察ER、PR的阳性面积及平均光密度。

1.7 统计学方法

采用SPSS17.0软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析；计数资料采用卡方检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠死亡时间、数量和一般情况说明

模型组大鼠造模期间死亡21只（第3星期死亡1只，第6星期死亡10只，第9星期死亡8只，第12星期死亡2只），成活率为76.7%；空白组死亡0只，成活率为 100.0%。两组成活率比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。模型组大鼠死亡原因可能是DMBA引起的毒性反应，且第6～9星期是DMBA诱导的乳腺癌大鼠的死亡高峰期。

造模 15星期后，模型组除去检验造模成功的大鼠3只、未能诱导出乳腺癌的大鼠12只（原因不明），再随机分为治疗组和对照组，每组27只。对照组在治疗过程中死亡4只，死亡原因不明。故实验结束时（第27星期），空白组大鼠存活30只，治疗组存活27只，对照组大鼠23只。

2.2 各组大鼠治疗结束后乳腺肿瘤平均数目和平均体积比较

表 1 各组大鼠治疗结束后乳腺肿瘤平均数目和平均体积比较 （±s）

表 1 各组大鼠治疗结束后乳腺肿瘤平均数目和平均体积比较 （±s）

注：与空白组比较1）P＜0.01；与对照组比较2）P＜0.05

组别 　n 　 平均数目（个） 　 平均体积（cm3）治疗组 　27 　1.51±0.411）2）　1.93±0.571）2）对照组 　23 　1.97±0.331）　2.59±1.011）空白组 　30 　0.00±0.00 　0.00±0.00

由表 1可见，治疗组治疗后乳腺肿瘤平均数目和平均体积与对照组和空白组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。对照组治疗后乳腺肿瘤平均数目和平均体积与空白组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 各组大鼠治疗后各项肿瘤标志物浓度比较

由表 2可见，治疗组和对照组治疗后各项肿瘤标志物（CA724、CA125、CA199、AEP、CA15-3、CEA及CA50）浓度与空白组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。治疗组治疗后CA15-3浓度与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

表2 各组大鼠治疗后各项肿瘤标志物浓度比较（±s，U/mL）

表2 各组大鼠治疗后各项肿瘤标志物浓度比较（±s，U/mL）

注：与空白组比较1）P＜0.05，2）P＜0.01；与对照组比较3）P＜0.01

指标 　　治疗组（n=27） 　对照组（n=23） 　空白组（n=30）糖链抗原CA724 　0.15±0.101）　0.17±0.151）　0.11±0.10糖链抗原CA125 　0.22±0.201）　0.25±0.101）　0.17±0.05糖链抗原CA199 　1.29±0.301）　1.41±0.171）　1.05±0.05甲胎蛋白（AEP） 　0.24±0.351）　0.32±0.161）　0.22±0.10糖链抗原CA15-3 0.33±0.201）3）　0.64±0.132）　0.30±0.10癌胚抗原（CEA） 　0.21±0.041）　0.38±0.051）　0.20±0.15糖类抗原CA50 　2.30±0.301）　2.40±0.361）　1.20±0.10

2.4 各组大鼠肿瘤组织病理学表现

于治疗结束后（第 27星期）取各组较典型的病理学图片。由图1可见，与空白组比较，治疗组癌组织呈浸润性生长，实质与间质分界清楚； 癌细胞排列失去极性，细胞大小不等，形态各异； 核质比例增大； 核染色深，核仁大而清楚，可见分泌物及坏死组织，可见病理性核分裂像。对照组癌组织呈浸润性生长，排列成条索状或团块状； 细胞排列紊乱，失去正常的结构和层次，胞核增大，浓染，异型性明显，核仁大而清楚，可见病理性核分裂像。

图1 各组大鼠肿瘤组织病理学表现

2.5 各组治疗后第2、3对乳腺组织ER、PR的表达

2.5.1 各组大鼠治疗后ER阳性面积和平均光密度比较

由表3、图2可见，治疗组大鼠治疗后ER阳性面积和平均光密度与对照组和空白组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。对照组大鼠治疗后ER阳性面积和平均光密度与空白组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。

表3 各组大鼠治疗后ER阳性面积和平均光密度比较（±s）

表3 各组大鼠治疗后ER阳性面积和平均光密度比较（±s）

注：与空白组比较1）P＜0.01；与对照组比较2）P＜0.01

组别 　n 　　阳性面积（μm2） 　　平均光密度治疗组 　27 　341.13±187.731）2）　0.22±0.071）2）对照组 　23 　758.03±514.231）　0.36±0.041）空白组 　30 　0.00±0.00 　0.00±0.00

2.5.2 各组大鼠治疗后PR阳性面积和平均光密度比较

由表4、图3可见，治疗组大鼠治疗后PR阳性面积和平均光密度与对照组和空白组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。对照组大鼠治疗后PR阳性面积和平均光密度与空白组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。

表4 各组治疗后PR阳性面积和平均光密度比较 （±s）

表4 各组治疗后PR阳性面积和平均光密度比较 （±s）

注：与空白组比较1）P＜0.01；与对照组比较2）P＜0.01

组别 　n 　　阳性面积（μm2） 　　平均光密度治疗组 　27 　445.61±232.441）2）　0.22±0.101）2）对照组 　23 　985.33±497.531）　0.32±0.141）空白组 　30 　0.00±0.00 　0.00±0.00

图2 各组ER阳性面积及平均光密度

图3 各组PR阳性面积及平均光密度

3 讨　论

大鼠乳腺癌模型的建立有诱发性、种植性和自发性 3种类型，以 DMBA 诱导大鼠乳腺癌属于诱发性模型，是较为成熟的乳腺癌动物模型，广泛用于肿瘤的病理形态学、分子生物学、影像诊断和药物治疗等研究。有研究［6-7］证实，DMBA诱导大鼠乳腺癌及癌前病变发生的动态过程是经过乳腺导管上皮细胞“正常-一般增生-非典型增生-原位癌-浸润癌”的逐渐演变过程，与人体乳腺增生到癌变发展的特点相似。所以，研究 DMBA诱导的乳腺癌大鼠对防治人体乳腺癌有着现实意义。本实验的动物模型参照邹利光等［8］描述的方法建立，予SD大鼠分两次胃管灌注DMBA混悬液（10 mg DMBA/ 1 mL芝麻油）l00 mg/kg体重。DMBA是强力致癌剂，其对乳腺的选择作用强，作用机理可能是在微粒体的轻化酶系作用下，经过经基化、环氧化等代谢过程最终产生致癌物，引起 DNA损伤，细胞突变，使正常细胞分化受阻，出现异常增生，最终形成肿瘤［9］。本实验采用DMBA诱导的大鼠乳腺癌模型，成活率高，诱发成功率高。与空白组比较，治疗组和对照组大鼠乳腺肿瘤发生的数目较多，肿瘤体积较大（均 P＜0.01）；与对照组比较，治疗组大鼠乳腺肿瘤发生的数目明显下降，肿瘤体积也显著缩小，两组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）。说明针刺可通过减少DMBA诱导的大鼠乳腺肿瘤发生的数目及减小肿瘤体积，来防治大鼠乳腺肿瘤的发生和发展。

肿瘤标志物是由肿瘤组织产生的反应肿瘤自身存在的化学物质［10］，分为肿瘤特异性和肿瘤相关性两种，绝大多数肿瘤标志物属于后一种，肿瘤相关性标志物因在正常组织和肿瘤组织中均可存在，所以其特异性相对较差。本实验结果显示，治疗组和对照组治疗后肿瘤标志物糖链抗原CA724、糖链抗原CA125、糖链抗原CA199、甲胎蛋白（AEP）、糖链抗原CA15-3、癌胚抗原（CEA）及糖类抗原 CA50浓度均显著升高，与空白组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，治疗组糖链抗原 CA15-3 浓度显著降低，两组比较差异具有统计学意义（P＜0.01）。而CA15-3是目前应用最为广泛的乳腺癌血清标志物［11］，其对乳腺肿瘤诊断的阳性率高达54.6%，且越晚期的肿瘤，CA15-3的阳性率越高［12］。CA15-3通过化学发光酶免疫法定量分析人血清或血浆中的糖蛋白CA15-3的浓度，其浓度的变化与治疗效果密切相关，是乳腺癌患者诊断、监测术后复发和观察疗效的最佳指标。本实验结果说明针刺有调节血清中糖链抗原CA724、糖链抗原CA125、糖链抗原CA199、甲胎蛋白（AEP）、癌胚抗原（CEA）、糖类抗原CA50浓度的作用，特别是调节糖链抗原CA153 的浓度，提示针刺可以调节乳腺肿瘤细胞的增值、分化和凋亡，从而达到防治乳腺肿瘤的目的。

ER、PR是目前临床上应用最为普遍、对制定乳腺癌治疗方案最为重要的指标，对评判预后有着极其重要的价值［13-15］。周导等［16］采用免疫组化法测定乳腺增生模型大鼠第2、3对乳腺组织中ER、PR表达情况，结果发现，模型组大鼠ER、PR阳性强度和数量随着乳腺增生程度的加重而增加，提示ER、PR在乳腺中的表达情况与乳腺增生程度密切相关。有研究［17-23］表明，针刺可调节ER、PR蛋白表达，对乳腺疾病有一定的防治作用。本实验采用免疫组化方法对乳腺癌病变大鼠进行了ER、PR检测，并利用微机图像分析系统对其阳性面积和平均光密度进行了定量分析。图像分析测量结果快速、精确、可重复，此法是目前公认的病理学量化研究手段之一，通过对阳性面积、平均光密度进行图像定量分析，更能客观科学地反映乳腺癌变组织细胞的生物学特性。本实验对各组大鼠ER、PR表达的影响结果显示，与空白组比较，治疗组和对照组ER、PR阳性面积和平均光密度均较高（P＜0.01）；与对照组比较，治疗组 ER、PR阳性面积和平均光密度明显下降（P＜0.01），提示针刺治疗可减少ER、PR的阳性面积和平均光密度，这可能是本法防治大鼠乳腺癌的主要途径之一，说明针刺足三里、三阴交、膻中等穴位可能是以ER、PR为靶点而阻断和逆转乳腺癌大鼠病变的发生和发展。

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【中图分类号】R2-03

【文献标志码】A

DOI：10.13460/j.issn.1005-0957.2016.03.0344

文章编号：1005-0957（2016）03-0344-05

收稿日期2015-10-16

基金项目：云南省中青年学术技术带头人后备人才项目（2012HB034）；云南省教育厅科学研究基金项目（2015J103）

作者简介：曹加伟（1990 - ），男，2014级硕士生

通信作者：赵荣（1972 - ），女，教授，硕士生导师，Email：382053812@qq.com

Effect of Acupuncture on ER and PR Expressions in Rats with DMBA-induced Mammary Cancer

CAO Jia-wei， HUANG Mei， YAN Jing， XU Jin-long， YANG Zeng-rong， HUANG Kun， ZHU Zhu， ZHAO Rong.
Yunnan College of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650000，China

［Abstract］Objective To investigate the effect of acupuncture at Zusanli， Sanyinjiao and Danzhong on mammary estrogen receptor （ER） and progesterone receptor （PR） expressions in rats with dimethylbenzanthracine （DMBA）-induced mammary cancer. Methods One hundred and twenty female SD rats aged 6-8 weeks were randomized into a model group of 60 rats and a blank group of 30 rats. The model group received an oral gavage of DMBA for model making. The blank group received an oral gavage of equal volume of sesame oil. At 15 weeks after model making， the model group of rats was randomized into treatment and control groups. The treatment group received acupuncture at Zusanli， Sanyinjiao and Danzhong， and the control and blank groups， only the same grasp and release. After the completion of acupuncture treatment （twenty-seventh week）， abdominal venous blood was taken and serum tumor markers were determined by electrochemiluminescence immunoassay. Tumor masses were counted and their shapes were recorded. The mass was taken and its height， maximum diameter and vertical diameter were measured using a 1 mm precision vernier caliper. Pathological changes in tumor tissues， and ER and PR positive areas and mean optical densities were observed under an Olympus optical microscope. Results There were statistically significant post-treatment differences in the average number and volume of mammary tumors between the treatment group and the control or blank group （P＜0.01， P＜0.05） and between the control and blank groups （P＜0.01）. There were statistically significant post-treatment differences in the concentrations of various tumor markers （CA724， CA125， CA199， AEP， CA15-3， CEA and CA50） between the treatment or control group and the blank group （P＜0.01， P＜0.05） and between the control and blank groups （P＜0.01）. There was a statistically significant post-treatment difference in CA15-3 concentration between the treatment and control groups （P＜0.01）. There were statistically significant post-treatment differences in ER and PR positive areas and mean optical densities between the treatment group and the control or blank group （P＜0.01） and between the control and blank groups （P＜0.01）. Conclusions Acupuncture can reduce the occurrence of rat DMBA-induced mammary tumor （including the number and volumes of the tumors）. The mechanism of its action may be related to decreasing the concentrations of tumor markers CA724， CA125， CA199， CA15-3， AEP， CEA and CA50 and especially to decreasing CA15-3 concentration， and ER and PR positive areas and mean optical densities.

［Key words］Acupuncture therapy； Mammary cancer； Point， Zusanli； Point， Sanyinjiao； Point Danzhong； Estrogen receptor；Progesterone receptor； Dimethylbenzanthracine； CA15-3s； Rats