芦竹愈伤组织诱导及再生体系的建立

阳宴清，王 咏，2，朱美兰，2，卢运海

(1.福建农林大学作物科学学院，福建 福州350002； 2.国家菌草工程技术研究中心，福建 福州 350002)



芦竹愈伤组织诱导及再生体系的建立

阳宴清1，王 咏1，2，朱美兰1，2，卢运海1

(1.福建农林大学作物科学学院，福建 福州350002； 2.国家菌草工程技术研究中心，福建 福州 350002)

摘要：本研究首先对芦竹(Arundo donax)的侧枝茎尖及带腋芽幼茎段进行了根诱导并产生无菌苗，然后对芦竹的幼叶段、无菌苗叶段、根段、无菌苗茎段、带腋芽幼茎段5种外植体进行了愈伤组织的诱导试验，建立从愈伤组织到再生植株的培养体系。结果表明，MS+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT既可以促进侧枝茎尖及带腋芽幼茎段根系的发育，也能促进二者芽的生长，从而产生无菌苗。在MS+1.0 mg·L-12,4-D+0.1 mg·L-1KT培养基上，幼叶段和无菌苗叶段都没能产生愈伤，少数根段产生了愈伤但量很少，多数的无菌苗茎段都能产生愈伤但量相对较少；而带腋芽幼茎段则可以在腋芽基座部位诱导出大量的愈伤组织，经过继代增殖可形成质地松软的乳白色愈伤，放置于MS+0.5 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA培养基上可同时分化出大量的根和芽来，显示了芦竹的愈伤组织具有很强的分化和再生能力，也表明在芦竹上可以通过愈伤组织的诱导、分化及植株再生这一技术体系来大大提高其繁殖系数。本研究可以为优良芦竹品种的快繁以及在芦竹上开展现代生物技术的研究和应用提供初步的技术基础。

关键词:芦竹；带腋芽幼茎段；愈伤组织诱导；植株再生；快繁

芦竹(Arundodonax)属于禾本科芦竹属多年生草本植物[1]，原分布于热带及亚热带地区，在南非、厄立特里亚、墨西哥、意大利、埃及、日本等国家以及在我国的江苏、浙江、湖南、福建、台湾等地都有分布，多生长于河流、湖泊岸边及道路两旁。其外形既像芦苇又像竹子，丛生，一年内多次发笋，具有粗而多节的根状茎，株高可达2～6 m，喜欢潮热，但也耐低温、干旱，在我国北方-28 ℃条件下也能够安全越冬，具有较强的耐碱、抗旱性，比较适合在盐碱地种植[2-3]。芦竹含有丰富的生物活性物质，其根茎为民间常用的中草药之一[4-9]；芦竹具有优良的纤维，产量可达3～5 t·667 m-2，是一种优质高产的造纸原材料植物[10-14]；芦竹也可以作菌草用于香菇、木耳、灵芝等多种食用菌栽培的优质培养料[1，15]；芦竹长势雄伟壮观，姿态别致，除做河岸、湖边等处观赏植物之外，还可以固坡护堤、防沙固沙，是荒漠化地区恢复植被的优良草种[1]；越来越多的研究表明，芦竹对被重金属污染的土壤、湿地及废水等具有净化、修复的功效，可以作为植物修复技术应用中的重要植物资源之一[16-33]；芦竹生物量大，根系发达，适应性强等特点，使其成为当今重要的能源植物之一[34-38]。

芦竹的常规繁殖方式为分蘖繁殖、扦插繁殖等[39]，但常规繁殖方式远不能满足大规模的园林建设、生态建设以及大面积生产栽培对芦竹种苗的大量需求。目前为止，有关芦竹快繁技术研究的报道很少。花叶芦竹(A.donaxvar.versicolor)的幼芽在MS+4～6 mg·L-16-BA+1～4 mg·L-1IAA培养基上进行微繁殖，1个芽经过6个月的培养平均增殖到731个芽，即平均每个芽在每个月的繁殖速度为3.0倍[40]；芦竹腋芽在MS+2～5 mg·L-16-BA+0.5～1 mg·L-1IBA培养基上进行微繁殖，1个腋芽半年后增殖到562个嫩芽[41-42]；刘文竹和赵惠恩[43]在冉隆贤等[41-42]的技术基础上，通过进一步优化所用激素浓度配方，使用MS+7.5 mg·L-16-BA+1 mg·L-1IBA的培养基经过4周的培养，将芦竹腋芽的增殖系数(增殖的芽数/外植体数量)提高到13.6[43]；将芦竹的侧枝腋芽浸泡在含有诱导激素(IAA+KT)的液态MS培养基中进行静止培养，该技术可以将1个植株经过4个月的繁殖增殖到900个植株[44]。

本研究以芦竹为试验材料，探讨芦竹的侧枝茎尖和带腋芽幼茎的根诱导培养、不同芦竹外植体产生愈伤组织的能力，以及愈伤组织诱导分化成植株的过程，旨在为芦竹的愈伤组织诱导和植株再生体系的建立提供试验依据，为提高芦竹优良品种的繁殖速度和系数以及在芦竹上开展生物技术研究和应用提供初步的技术基础。

1材料与方法

1.1试验材料

本研究用到的8个芦竹品种为绿洲1号、2号、3号、4号、5号、6号、7号和8号，由福建农林大学国家菌草工程技术研究中心提供。每个品种有3～5个丛生株群，种植在福建农林大学校内试验地。2014年秋季在一年生植株上采集不同的供试材料。

本研究共用幼叶段、无菌苗叶段、根段、无菌苗茎段、带腋芽幼茎段和侧枝茎尖6种外植体材料。1)幼叶段外植体：选芦竹侧枝顶尖部位尚未展开的幼嫩叶片，切成1～1.5 cm长的叶段；2)无菌苗叶段外植体：先将带腋芽幼茎段在MS-1培养基上诱导出无菌苗，然后将获得的无菌苗嫩叶片切成1～1.5 cm长的叶段；3)根段外植体：将成熟芦竹主茎切成含腋芽茎段，室温下浸泡在水中1周，在腋芽处产生白色根须，用剪刀剪下，切成2～3 cm长的根段；4)无菌苗茎段外植体：将预先获得的无菌苗幼茎切成1.5～2 cm长的茎段；5)带腋芽幼茎段外植体：在成熟芦竹植株上选取直径在3～5 mm的侧枝，将叶片和叶鞘剥去，用剪刀剪成1.5～2 cm长的含有腋芽的茎段；6)侧枝茎尖外植体：选直径在3～5 mm的侧枝，剪取其顶尖部位，剥去外围叶片和叶鞘，留2～3 cm长含有1～2个节的茎尖。

1.2试验方法

1.2.1外植体材料消毒处理将剪切好的外植体材料(不包括无菌苗叶段和茎段外植体)先用无菌水浸泡1～2 h，再冲洗两次。然后放入超净工作台，70%酒精消毒30 s，无菌水冲洗3次，2%次氯酸钠处理15 min，无菌水冲洗3次，置于无菌滤纸上吸干水分，接种到相应培养基上进行培养。

1.2.2培养基MS-1：MS基本培养基+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT；MS-2：MS基本培养基+1.0 mg·L-12,4-D+0.1 mg·L-1KT；MS-3：MS基本培养基+0.5 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA。MS基本培养基含蔗糖30 g·L-1、琼脂8 g·L-1, pH 5.8，加入适量激素比例后，分装到直径6 cm、高9 cm的专用玻璃瓶内(25 mL·瓶-1)，121 ℃高压灭菌 20 min，室温下凝固，4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.3侧枝茎尖和带腋芽幼茎段的根诱导及无菌苗的产生将消毒后的侧枝茎尖外植体和带腋芽幼茎段外植体以芽尖向上方向垂直插入MS-1培养基中，两种外植体各接种40瓶，每个芦竹品种接种5瓶，每瓶接种1个侧枝茎尖外植体或4个带腋芽幼茎段外植体，进行根诱导培养，30～40 d后进行继培或移栽到土壤中。

1.2.4愈伤组织的诱导及增殖将上述幼叶段、无菌苗叶段、根段、无菌苗茎段和带腋芽幼茎段5种不同芦竹外植体分别接种到MS-2培养基上进行愈伤组织诱导培养，每种外植体接种40瓶，每个品种接种5瓶，每瓶内接种4个外植体。带腋芽幼茎段外植体，1/2为垂直腋芽尖向上方向插入培养基中，另外1/2为水平且部分嵌入培养基中放置。培养30～40 d后，将诱导出的愈伤组织切块转接到新的MS-2培养基上进行继代培养，继培30～40 d后新获得的愈伤组织可以进一步被切块转接到新的MS-2培养基上进行继代增殖培养。

1.2.5愈伤组织的分化及植株再生将经过至少1次继代培养增殖出的愈伤组织切块转接到MS-3培养基上进行分化培养，直接诱导出根和芽。

1.2.6培养条件本研究使用由江南仪器厂生产的光照培养箱(RXZ-280D)，除了愈伤组织继培和增殖条件为暗培养外，其余试验皆在光照强度为6 000 lx，光照时间为12 h·d-1的条件下进行，培养温度为28 ℃。

1.2.7组培苗的驯化和移栽由侧枝茎尖和带腋芽幼茎段根诱导以及愈伤组织诱导分化产生的组培苗，在确定移栽前，先拧松瓶盖1 d，再打开瓶盖2 d进行炼苗，然后取出幼苗用自来水洗掉根部的残余培养基，最后移栽到土壤中，放置在适当环境下进行培养。

1.2.8数据统计根据观察数据计算出生根率、出愈率和植株再生率。对因污染而无法统计结果的培养瓶，进行补充试验和替换。

生根率=(产生根的外植体个数/根诱导接种的外植体总数)×100%；

出愈率=(产生愈伤组织的外植体个数/愈伤诱导接种的外植体总数)×100%；

植株再生率=(再生出植株的愈伤块数/植株诱导接种的总愈伤块数)×100%。

2结果与分析

2.1侧枝茎尖和带腋芽幼茎段根诱导

芦竹的侧枝茎尖和带腋芽幼茎段两种外植体在MS-1(MS+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT)培养基上都可以被诱导出根系来，诱导率高达100%(表1)。芦竹的侧枝茎尖基部在MS-1培养基上培养40 d后被诱导出根的同时也可以产生新的幼芽(图1A)；带腋芽幼茎段在根系被诱导的同时，其腋芽可以正常发育(图1B)；由此产生的幼苗经炼苗驯化后，可以直接移栽到土壤中，成活率达100%(图1C，D)。

2.2不同外植体愈伤组织的诱导及增殖

在MS-2培养基上进行愈伤组织诱导培养30 d后，芦竹的幼叶段未能被诱导出任何愈伤组织，且在培养基上呈逐渐萎缩、死亡现象(图2A)；无菌苗的叶段同样也没产生任何愈伤组织，但叶片状态保存相对完好(图2B)；只有少数根段在经过30 d诱导培养后，在根端部位被诱导出少量的愈伤组织，而其余绝大多数试验根段没有产生任何愈伤组织，但保持存活状态(图2C)。无菌苗的茎段全部呈逐渐萎缩、死亡现象，但有2/3的无菌苗茎段的一端产生少量白色的愈伤组织，而其余的1/3未能产生愈伤组织(图2D)。

表1　8个芦竹品种的两种外植体在MS+0.2 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 KT培养基上的根诱导Table 1　The rooting rates of 2 types of explants from 8 giant reed cultivares on the MS medium with 0.2 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 KT

图1　两种不同芦竹(芦竹3号)外植体在MS+0.2 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 KT培养基上的根诱导情况Fig.1　Rooting of 2 different types of giant reed (Luzhu No.3)explants on the MS medium with 0.2 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 KT

注：A,侧枝茎尖(40 d);B,带腋芽幼茎段(40 d);C,产生的无菌苗移栽到土壤中的第1天;D,无菌苗在土壤中生长第15天。

Note: A, lateral shoot tips(40 d); B, young stem segments with axillary buds (40 d); C, transplanting of aseptic seedlings in soil (1 d); D, transplanting of aseptic seedlings in soil (15 d).

带腋芽幼茎段外植体在MS-2培养基上，除去少数茎段的腋芽在培养过程中未能发育外，其余带腋芽茎段都被成功诱导出了愈伤组织。垂直插在MS-2培养基中培养10 d后，腋芽在生长的同时伴随着根的生长，当根尖接触到培养基时被去分化从而形成愈伤组织(图2E)；平放在MS-2培养基中的茎段的愈伤组织被诱导10 d后，由于直接和培养基接触，腋芽基部被去分化、膨大从而发育成愈伤组织(图2F)；垂直插在MS-2培养基中培养20 d后，腋芽向上能正常发育成幼苗，但在其基座部位不产生任何根须而是形成不断膨大的乳白色愈伤组织(图2G)；继续培养40 d后，在腋芽基座部位形成大量的、部分嵌入到培养基中的愈伤组织(图2H)。带腋芽幼茎段外植体，最初产生的愈伤组织质地相对紧实，颜色呈黄褐色并带有少量的绿色。将其切成小块，在25 ℃暗光下进行继代增殖培养30 d后即可获得乳白色质地松软的愈伤组织(图2I)。

愈伤诱导试验结果(表2)表明：在本试验条件下，芦竹带腋芽幼茎段最适合做外植体来生产愈伤组织，出愈率高达100%；无菌苗茎段外植体的出愈率为55%～65%；根段外植体的出愈率只有0～10%；幼叶段外植体和无菌苗叶段外植体的出愈率全部是0。

2.3愈伤组织的分化及植株再生

将8个芦竹品种的带腋芽幼茎段外植体诱导产生的愈伤组织经过继代增殖1～2次后切块放入MS-3(MS+0.5 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA)培养基上进行分化培养，植株再生率高达100%(表3)。继代增殖的愈伤组织质地疏松易碎(图2I)，在接种到分化培养基上的7～8 d开始出现绿色的斑点，14 d时多数绿色的斑点分化成嫩芽(图3A)，30 d后分化出大量的嫩芽(图3B)，同时也分化出了大量的多数为绿色的根系(图3C)，由此产生的组培苗经炼苗驯化后，可以直接移栽到土壤中，成活率达100%(图3D)。

图2　不同类型的芦竹(绿洲3号)外植体在MS+1.0 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1 KT培养基上的愈伤组织诱导Fig.2　Callus induction of different types of giant reed (Lvzhou No.3) explants on the MS medium with 1.0 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1 KT

注：A,幼叶段(30 d);B,无菌苗叶段(30 d);C,根段(30 d);D,无菌苗茎段(30 d);E,竖放的带腋芽幼茎段(10 d);F,平放的带腋芽幼茎段(10 d);G,竖放的带腋芽幼茎段(20 d);H,平放的带腋芽幼茎段(40 d);I,由带腋芽幼茎段产生的愈伤组织的继代培养(30 d)。

Note: A,young leaf segments (30 d); B, young leaf segments of aseptic seedlings (30d); C, root segments (30 d); D, stem segments of aseptic seedlings (30 d); E, vertically placed stem segments with axillary buds (10 d); F, horizontally placed stem segments with axillary buds (10 d); G, vertically placed stem segments with axillary buds (20 d); H, horizontally placed stem segments with axillary buds (10 d) transplanting of aseptic seedlings in soil (40 d); I, re-culture of calli induced from stem segments with axillary buds (30 d).

3讨论与结论

植物组织培养过程中可以通过使用不同类型、浓度和不同配比的植物生长调节剂来调节外植体的分化方向及器官发生。一般来讲，生长素和细胞分裂素的比例影响着植物器官分化，比例高时，有利于根的分化；比例低时，有利于芽的分化；比例适中时，则促进愈伤组织的形成。本研究选用了含有0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT的配比浓度的培养基来培养芦竹侧枝茎尖以及带腋芽幼茎段，该配比浓度既可以促进根系的发育，也能促进芽的生长；产生的无菌苗可以做外植体材料用于新的组织培养，也可以移栽到土壤中进行大田繁殖(图1)。本研究在芦竹上首次将侧枝茎尖诱导出根系培育成幼苗。未来研究可以在本研究的基础上，同时参照叶保君和李春玲[40]、冉隆贤等[41-42]、刘文竹和赵惠恩[43]在芦竹上的研究结果，通过试用不同的调节剂及其浓度、比例，来寻找可以提高带腋芽茎段的幼芽分化数的最佳培养基配方，提高芦竹通过带腋芽茎段进行快繁的增殖系数。

外植体的选择是愈伤组织诱导和建立再生体系的第一环节。本研究首次在芦竹上试用了根段、幼叶段、无菌苗叶段、无菌苗茎段和带腋芽幼茎段5种不同芦竹外植体，在含有1.0 mg·L-12,4-D+0.1 mg·L-1KT的培养基上进行愈伤组织诱导，幼叶段和无菌苗叶段都不能产生愈伤组织，根段在少数情况下可以产生少量的愈伤组织，无菌苗茎段在多数情况下都可以产生愈伤组织，但量相对较少，带腋芽幼茎段做外植体可以诱导出大量的愈伤组织且可以通过继代培养进行增殖从而产生大量的质地松软的乳白色愈伤组织。因此，芦竹带腋芽幼茎段最适合做外植体来生产愈伤组织。此外，成熟芦竹在去顶后可诱发生长出大量细的侧枝，这为芦竹愈伤组织的生产提供外植体材料的保障。

表2　5种芦竹外植体在MS+1.0 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1 KT培养基上的愈伤组织诱导Table 2　The callus induction rates of 5 types of explants from 8 giant reed varieties on the MS medium with 1.0 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1 KT

表3　来自8个不同芦竹品种的愈伤组织在MS+0.5 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA培养基上的分化及植株再生Table 3　The plant regeneration rates of calli derived from the stem segments with axillary buds of 8 giant reed cultivars on the MS medium with 0.5 mg·L-1 KT+1.0 mg·L-16-BA

图3　芦竹(绿洲3号)愈伤组织在MS+0.5 mg·L-1 KT+1.0 mg·L-1 6-BA培养基上的分化及植株再生Fig.3　Plant regeneration of calli derived from the giant reed(Lvzhou No.3)stem segments with axillary buds on the MS medium with 0.5 mg·L-1 KT+1.0 mg·L-1 6-BA

注：A,愈伤组织经过14 d诱导培养;B,愈伤组织经过30 d诱导培养;C,愈伤组织经过30 d诱导培养的根系发育情况;D,诱导出的再生苗撮移栽到土壤中经10 d生长。

Note: A,callus differentiation after 14d’s induction; B, simultaneous shoot and root induction (30 d); C, rooting after 30 d’s induction; D, transplanting of regenerated plant clusters in soil (10 d).

将愈伤组织分化成植株幼苗是建立再生体系的关键环节，也是最难的环节。一般来讲，单子叶植物比双子叶植物要难以成功。本研究采用含有0.5 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA的培养基，直接将芦竹的愈伤组织分化出根和芽来，产生大量的幼苗，显示了单子叶植物芦竹的愈伤组织具有很强的分化和再生能力。分化出的幼苗撮可以很容易地在土壤中成活。因此，通过芦竹的愈伤组织诱导、分化及植株再生体系可以大大提高芦竹的繁殖系数。

本研究采用了3种培养基配方(MS-1、MS-2和MS-3)，分别进行了生根、愈伤诱导及植株再生试验，并获得了初步的结果。以后研究可以在此基础上，参照其它植物上的成功实验方案[45-48]，通过试用不同类型的激素及不同浓度的激素，观察其对不同外植体诱导生长的影响，针对不同培养目的和不同外植体，找出最佳培养基配方，进一步完善芦竹的组织培养及快繁技术。

随着国家对生态建设和环境保护的加强、菌草产业的蓬勃发展，芦竹的应用价值将被进一步的认识和挖掘，对芦竹的需求也将大大增多。芦竹在我国黄河两岸的生态建设、西北地区的沙漠治理、东部沿海盐碱地的绿化和治理等方面都可以发挥其重要作用。本研究结果为优良芦竹品种的快繁以及在芦竹上开展现代生物技术的研究和应用提供了初步的技术基础并展现出了广阔的前景。

致谢：本研究中用到的植物材料是由福建农林大学国家菌草工程技术研究中心的刘斌、林辉和吴金寿等老师提供，在此一并表示感谢。

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(责任编辑武艳培)

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0720

*收稿日期：2015-12-17接受日期：2016-02-24

基金项目：国家菌草工程技术研究中心攻关课题项目(JCGG14010)

通信作者：卢运海(1966-)，男，河北永年人，教授，博士，研究方向为植物分子遗传及生物技术。E-mail:yunhai.lu@fafu.edu.cn或yunhai.lu@hotmail.fr

中图分类号：Q945.39

文献标志码：A

文章编号：1001-0629(2016)7-1332-10*

Corresponding author:Lu Yun-haiE-mail: yunhai.lu@fafu.edu.cn; yunhai.lu@hotmail.fr

A study on callus induction and plant regeneration in giant reed (Arundodonax)

Yang Yan-qing1, Wang Yong1,2, Zhu Mei-lan1,2, Lu Yun-hai1

(1.College of Crop Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China；2.China National Engineering Research Center of JUNCAO Technology, Fuzhou 350002, China)

Abstract:In this study, the aseptic seedlings of giant reed (Arundo donax) were firstly obtained from lateral shoot tips and young stem segments with axillary buds by root and bud induction on the MS medium with 0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT. Then, five types of explants, including root segments, leaf segments, leaf segments of aseptic seedlings, stem segments of aseptic seedlings, stem segments with axillary buds, were examined for their callus inducing capacity on the MS medium with 1.0 mg mg·L-12,4-D+0.1 mg·L-1KT. The results indicated that, no callus was induced from leaf segments as well as leaf segments of aseptic seedlings, only a small quantity of calli were induced from root segments but in rare cases, a low quantity of calli were induced from stem segments of aseptic seedlings in majority cases, and a large quantity of calli were induced in the base of axillary buds of stem segments. After 1～2 rounds of re-culture on the same medium, the calli (with an improved quality as well as an increased quantity) were transferred on the MS medium with 0.5 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA, on which both shoots and roots were simultaneously induced with a large quantity, indicating a high capacity of callus differentiation and high propagation coefficient by plant regeneration in giant reed. This study provides a technical support for the application of biotechnology in giant reed breeding and propagation.

Key words:giant reed; stem segments with buds; callus induction; plant regeneration; rapid propagation

阳宴清,王咏,朱美兰,卢运海.芦竹愈伤组织诱导及再生体系的建立.草业科学,2016,33(7)：1332-1341.

Yang Y Q,Wang Y,Zhu M L,Lu Y H.A study on callus induction and plant regeneration in giant reed (Arundodonax).Pratacultural Science，2016,33(7)：1332-1341.

植物生产层

第一作者：阳宴清(1985-)，女，四川西充人，科研助理，学士，研究方向为植物生物技术。E-mail:604156945@qq.com