雷公藤红素逆转宫颈癌细胞顺铂耐药性实验研究

2016-08-02孙菊萍姜凯

浙江中西医结合杂志 2016年7期

孙菊萍姜凯

孙菊萍1姜凯2

目的研究中药活性成分雷公藤红素逆转耐药宫颈癌细胞株Hela/R对顺铂的耐药性，并探讨其机制。方法采用顺铂梯度暴露法构建顺铂耐药宫颈癌细胞株Hela/R；采用MTT法检测雷公藤红素是否能增强顺铂对Hela/R的杀伤活性；Western blot试验检测常规Hela细胞及Hela/R细胞抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-w及Bcl-xl表达水平；流式细胞术检测雷公藤红素联合顺铂对Hela/R细胞的凋亡诱导效应及对线粒体膜电位的影响。结果1、2、4、8、16、32、64μmol/L顺铂对Hela及Hela/R细胞的细胞活力抑制率分别为：（18.6±1.5）%（Hela），（1.9±1.0）%（Hela/R）；（23.9±2.4）%（Hela），（3.1±1.2）%（Hela/R）；（47.8±3.9）%（Hela），（6.8±1.5）%（Hela/R）；（63.4±5.4）%（Hela），（11.6±1.8）%（Hela/R）；（72.7±5.9）%（Hela），（20.4±2.0）%（Hela/R），（85.7±6.7）%（Hela），（41.2± 3.3）%（Hela/R）；（91.8±7.9）%（Hela），（55.8±4.3）%（Hela/R），两组比较，P均＜0.05。2μmol/L雷公藤红素对Hela/R细胞的细胞活力抑制率为（6.6±1.1）%；2μmol/L雷公藤红素分别加10、20、40μmol/L顺铂组Hela/R细胞的细胞活力抑制率优于单用10、20、40μmol/L顺铂组[（57.2±3.9）%比（12.4± 1.2）%、（71.4±5.1）%比（27.8±1.9）%、（84.8±6.8）%比（45.2±3.1）%，P＜0.05]。Hela/R细胞Bcl-w/βactin表达水平高于Hela细胞[（70.9±4.9）比（22.1±1.3），P＜0.05]，Bcl-2/β-actin与Bcl-xl/β-actin表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组比较，雷公藤红素可明显抑制Hela/R细胞Bcl-w/βactin的表达[（29.3±2.6）比（68.9±4.5），P＜0.05]。雷公藤红素增强顺铂对Hela/R细胞线粒体膜电位的损伤，促进细胞色素C的释放，而诱导Hela/R细胞发生凋亡。结论雷公藤红素体外能提高顺铂对耐药宫颈癌细胞的杀伤活性，其机制可能为通过抑制Bcl-w表达，提高促凋亡蛋白的活性，进而促进耐药宫颈癌细胞发生线粒体途径的凋亡。

耐药宫颈癌细胞株；顺铂；Hela/R；雷公藤红素；Bcl-w；线粒体；凋亡

宫颈癌是全球发病率第二位的妇科肿瘤，每年有超过50万患者被诊断为宫颈癌，化疗目前仍是治疗宫颈癌的主要手段[1]。顺铂是治疗多种实体瘤的一线药物，它能损伤肿瘤细胞的DNA进而诱导细胞进入凋亡程序[2]。然而，顺铂的反复使用常常诱导肿瘤细胞产生耐药性，抵抗顺铂诱导的凋亡效应[3]。因此，寻找其他的药物与顺铂进行联合用药以延缓顺铂的耐药性是目前肿瘤治疗研究的重点。本研究的目的在于探讨中药活性成分雷公藤红素是否能逆转耐药宫颈癌细胞株Hela/R对顺铂的耐药性并研究其具体机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与Hela/R的构建人宫颈癌细胞系Hela购于美国ATCC（American Type Culture Collection），肿瘤细胞培养在RPMI-1640培养基中，含10%胎牛血清，培养环境为37℃恒温且通入5%的CO2。顺铂耐药Hela（Hela/R）细胞的构建采用顺铂梯度暴露法[4]：将Hela细胞用一个浓度的顺铂处理48h，之后将其移至无顺铂培养基培养48h，重复3次后将细胞移至更高浓度顺铂进行培养。顺铂初始培养浓度为1μmol/L，后每轮增加0.5μmol/L，直至将Hela/R细胞最终培养在含3μmol/L顺铂的培养基中。

1.2 实验试剂RPIM-1640培养基和胎牛血清购自于Gibco公司。顺铂、雷公藤红素、地高辛、JC-1、噻唑蓝（MTT）、AnnexinⅤ凋亡试剂盒购自美国sigma公司。β-actin、Bcl-2、Bcl-w、Bcl-xl、细胞色素C抗体购自美国Cell signal公司。ECL试剂盒购于美国Pierce。pcDNA3.1，Lipofectamine 2000购于美国Invitrogen。

1.3 质粒构建及转染将Bcl-w基因cDNA全长序列（Gene ID：NM_001199839）以分子克隆的方法与pcDNA3.1连接后构建成pcDNA3.1-Bcl-w重组真核表达质粒[5]。使用Lipofectamine 2000按照试剂操作说明书步骤将2μg/mL Bcl-w表达质粒转染入Hela/ R细胞中，培养24h。

1.4 MTT试验将Hela或Hela/R细胞按5×103/孔接种在96孔板上。将2μg/mL Bcl-w表达质粒转染到细胞中，孵育24h，然后再加2μmol/L雷公藤红素及不同浓度的顺铂培养48h，顺铂0μmol/L为对照组。之后加5mg/mL MTT 20μL，继续培养4h。弃上清，在570nmol/L波长下用酶标仪检测OD值，细胞活力抑制率用以下公式计算：抑制率=（OD对照组-OD治疗组）/OD对照组×100%。

1.5 Western blot试验将2μg/mL Bcl-w表达质粒转染到Hela/R细胞中，孵育24h，然后再加2μmol/ L雷公藤红素及10μmol/L顺铂培养48h。之后将Hela或Hela/R细胞用生理盐水洗涤两次，之后将细胞裂解，将蛋白裂解液用12.5%SDS PAGE进行分离，之后通过电转方法将蛋白质转到PVDF膜上。将膜放入β-actin、Bcl-2、Bcl-w、Bcl-xl、细胞色素C一抗稀释液中孵育过夜，之后再用二抗稀释液孵育2h后在X胶片上进行曝光，之后用Image J图像处理软件进行处理，使蛋白表达灰度值用数字表示，目标蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/相应β-actin内参蛋白灰度值。

1.6 线粒体膜电位测定将2μg/mL Bcl-w表达质粒转染到Hela/R细胞中，孵育24h，然后再加2μmol/ L雷公藤红素及10μmol/L顺铂培养48h后，将细胞用生理盐水洗涤两次，加入5μmol/L JC-1孵育20min，用流式细胞术检测细胞的线粒体膜电位。线粒体膜电位丧失的细胞不发射JC-1的红色荧光，因此Hela/R细胞的线粒体膜电位下降率用未发出红色荧光的细胞占所有细胞的百分比表示[6]。

1.7 细胞色素C释放率测定将2μg/mL Bcl-w表达质粒转染到Hela/R细胞中，孵育24h，然后再加2μmol/L雷公藤红素及10μmol/L顺铂培养48h。之后将Hela/R细胞重悬在地高辛裂解液中（75μg/mL地高辛溶解在250mmol/L蔗糖水溶液中）孵育15min，之后在15 000g中离心30min，所得的细胞沉淀中含完整的线粒体，而上清液中不含线粒体[7]。用Western blot方法分别检测细胞沉淀及上清液中细胞色素C表达水平，细胞色素C释放率用上清液中细胞色素C蛋白灰度与细胞沉淀中细胞色素C蛋白灰度的比值表示。

1.8 细胞凋亡试验将2μg/mL Bcl-w表达质粒转染到Hela/R细胞中，孵育24h，然后再加2μmol/L雷公藤红素及10μmol/L顺铂培养48h。将细胞用生理盐水洗涤两次，按照凋亡试剂盒说明书步骤将Annexin-V加入细胞中孵育20min，采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡，细胞凋亡率用Annexin-V阳性细胞占所有细胞比值表示。

2 结果

2.1 雷公藤红素逆转Hela/R的顺铂耐药相比于Hela细胞，Hela/R细胞对顺铂显著耐药，见表1。尽管低剂量的雷公藤红素（2μmol/L）单独治疗对Hela/ R细胞仅有微弱的杀伤作用，但显著增强顺铂对Hela/R细胞的杀伤活性，见表2。

表1 顺铂对Hela及Hela/R细胞的抑制作用（）

注：与对照组比较，*P<0.05；与相同浓度顺铂处理的Hela细胞组比较，#P<0.05

组别对照组1μmol/L顺铂组2μmol/L顺铂组4μmol/L顺铂组8μmol/L顺铂组16μmol/L顺铂组32μmol/L顺铂组64μmol/L顺铂组孔数顺铂浓度（μmol/L）3 3 3 3 3 3 3 3 0 1 2 4 8 1 6 32 64 Hela细胞活力抑制率（%）0 18.6±1.5* 23.9±2.4* 47.8±3.9* 63.4±5.4* 72.7±5.9* 85.7±6.7* 91.8±7.9* Hela/R细胞活力抑制率（%）0 1.9±1.0#3.1±1.2#6.8±1.5*#11.6±1.8*#20.4±2.0*#41.2±3.3*#55.8±4.3*#

2.2 雷公藤红素通过Bcl-w途径逆转Hela/R的顺铂耐药与Hela相比，Hela/R细胞的Bcl-2及Bclxl的表达水平变化不明显，但Bcl-w的表达水平显著提高，见表3。将Hela/R细胞用雷公藤红素治疗后，肿瘤细胞中Bcl-w的表达水平显著下调，而Bcl-2及Bcl-xl的表达水平未发生显著改变，见表4。当用Bcl-w表达质粒转染Hela/R细胞，使细胞强制表达Bcl-w后，雷公藤红素对顺铂治疗的协同作用丧失，见表5。

表2 雷公藤红素增强顺铂对Hela/R细胞的抑制作用（）

注：与对照组比较，*P<0.05；与10μmol/L顺铂组比较，#P<0.05；与20μmol/L顺铂组比较，△P<0.05；与40μmol/L顺铂组比较，○P<0.05

组别对照组雷公藤红素组10μmol/L顺铂组20μmol/L顺铂组40μmol/L顺铂组10μmol/L顺铂+雷公藤红素组20μmol/L顺铂+雷公藤红素组40μmol/L顺铂+雷公藤红素组孔数顺铂浓度（μmol/L）雷公藤红素浓度（μmol/L）3 3 3 3 3 3 3 3 0 0 1 0 20 40 10 20 40 0 2 0 0 0 2 2 2 Hela/R细胞活力抑制率（%）0 6.6±1.1* 12.4±1.2* 27.8±1.9* 45.2±3.1* 57.2±3.9*#71.4±5.1*△84.8±6.8*○

表3 Hela及Hela/R细胞Bcl-2抗凋亡蛋白家族成员的相对表达水平（）

注：与Hela细胞组比较，▲P<0.05

组别Hela细胞组Hela/R细胞组孔数3 3灰度比（Bcl-2/β-actin）37.9±1.8 41.4±2.1灰度比（Bcl-xl/β-actin）32.1±1.9 30.2±1.7灰度比（Bcl-w/β-actin）22.1±1.3 70.9±4.9▲

表4 雷公藤红素下调Hela/R细胞中Bcl-w的表达水平（）

注：与对照组比较，*P<0.05

组别对照组雷公藤红素组孔数雷公藤红素浓度（μmol/L）3 3 0 2灰度比（Bcl-2/β-actin）42.1±2.2 39.5±2.0灰度比（Bcl-xl/β-actin）29.6±1.8 27.4±1.7灰度比（Bcl-w/β-actin）68.9±4.5 29.3±2.6*

表5 Bcl-w表达质粒废除雷公藤红素对顺铂的协同作用（）

注：与对照组比较，*P<0.05，与顺铂+雷公藤红素组比较，#P<0.05

组别对照组顺铂+雷公藤红素组Bcl-w质粒组顺铂+雷公藤红素+Bcl-w质粒组孔数雷公藤红素浓度（μmol/L）Bcl-w质粒浓度（μg/mL）3 3 3 3顺铂浓度（μmol/L）0 10 0 10 0 2 0 2 0 0 2 2 Hela/R细胞活力抑制率（%）0 58.9±4.1* 1.0±0.7 17.9±3.1*#

表6 雷公藤红素联合顺铂诱导Hela/R细胞发生线粒体途径的凋亡（）

注：与对照组比较，*P<0.05；与10μmol/L顺铂组比较，#P<0.05；与2μmol/L雷公藤红素+10μmol/L顺铂组比较，△P<0.05

组别对照组2μmol/L雷公藤红素组10μmol/L顺铂组2μmol/L雷公藤红素+10μmol/L顺铂组2μmol/L雷公藤红素+10μmol/L顺铂+2μg/ml Bcl-w质粒组孔数3 3 3 3 3线粒体膜电位降低率（%）0 3.2±0.3 6.3±0.6* 45.5±3.1*#11.2±1.2*△细胞色素C释放率0.01±0.01 0.03±0.01 0.05±0.01* 0.41±0.03*#0.11±0.02*△细胞凋亡率（%）1.8±0.4 3.8±0.2 8.3±0.8* 49.4±3.3*#13.8±1.5*△

2.3 雷公藤红素联合顺铂诱导Hela/R细胞发生线粒体途径的凋亡雷公藤红素显著增强顺铂对Hela/R细胞线粒体膜电位的损伤并促使细胞色素C从线粒体中释放到细胞质中，诱导Hela/R细胞发生凋亡，见表6。

3 讨论

雷公藤红素是一种三萜类化合物，来源于中药雷公藤的根皮，具有多种生物活性。研究发现，雷公藤红素具有一定的抗肿瘤效应，如雷公藤红素在体外诱导前列腺癌细胞发生自噬性死亡[8]，还能通过诱导活性氧簇的生成引起结肠癌细胞发生凋亡[9]。Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡重要调节者，其中的Bcl-2抗凋亡蛋白成员（如Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w）能与Bcl-2促凋亡蛋白成员（如Bim、Bax、Bak）的特定位点发生结合，从而使这些促凋亡蛋白失去功能而起到凋亡抵抗的作用[10-11]。当肿瘤细胞出现凋亡信号（如DNA损伤）后，活化的促凋亡蛋白能打开肿瘤细胞的线粒体外膜孔道，使线粒体膜电位丧失，从而促使线粒体来源的促凋亡物质（如细胞色素C）释放到细胞质中。细胞色素C能直接诱导细胞进入caspase依赖的凋亡程序，使肿瘤细胞发生凋亡性死亡[12-13]。尽管已经有临床试验证明雷公藤红素有较好的抗肿瘤疗效和安全性[14]，但仍然缺乏其与其他抗肿瘤药物联合治疗宫颈癌的研究。

在本研究中，笔者构建了顺铂耐药的宫颈癌细胞模型，用以研究雷公藤红素是否能逆转肿瘤细胞对顺铂的耐药性，提高化疗疗效。本研究表明雷公藤红素确能提高耐药宫颈癌细胞对顺铂的敏感性，显著降低顺铂的治疗浓度。在机制研究中，笔者通过Western blot试验发现耐药宫颈癌细胞的Bcl-w表达水平异常升高，因此推测雷公藤红素可能通过抑制Bcl-w的功能实现对顺铂的协同效应。当用Bcl-w表达质粒转染Hela/R细胞，使Hela/R细胞强制表达Bcl-w后，笔者发现雷公藤红素对顺铂的协同效应显著下降，证明了Bcl-w途径在顺铂耐药中的重要作用。为了进一步研究雷公藤红素联合顺铂杀伤Hela/ R细胞的机制，笔者检测了肿瘤细胞的线粒体膜电位和细胞色素C的释放。结果发现雷公藤红素联合顺铂能诱导耐药宫颈癌细胞发生线粒体的损伤和细胞色素C的释放，进而促使耐药宫颈癌细胞发生凋亡性死亡。

综上所述，本研究结果证明了雷公藤红素在体外能提高顺铂对耐药宫颈癌细胞的杀伤活性，其分子机制可能为通过抑制Bcl-w的功能，提高促凋亡蛋白的活性，进而促进耐药宫颈癌细胞在顺铂的治疗下发生线粒体途径的凋亡。

［1］Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2013［J］. CA Cancer J Clin，2013，63（1）：11-30.

［2］Wang Y，Gao Y，Tan W，et al.Stanniocalcin 2 promotes cell proliferation and cisplatin resistance in cervical cancer［J］. Biochem Biophys Res Commun，2015，466（3）：362-368.

［3］Cao B，Shi Q，Wang W.Higher expression of SIRT1 induced resistance of esophageal squamous cell carcinoma cells to cisplatin［J］.J Thorac Dis，2015，7（4）：711-719.

［4］Ou Y，Zhai D，Li X，et al.Downregulation of miR-363 increases drug resistance in cisplatin-treated HepG2 by dysregulating Mcl-1［J］.Gene，2015，572（1）：116-122.

［5］Sun JG，Xiang J，Liu FY，et al.Clitocine induces apoptosis and enhances the lethality of celastrol in human colon cancer cells by disrupting the interaction of Mcl-1 and Bak［J］.Cancer Lett，2014，355（2）：253-263.

［6］Prathapan A，Vineetha VP，Raghu KG.Protective effect of Boerhaavia diffusa L.against mitochondrial dysfunction in angiotensin II induced hypertrophy in H9c2 cardiomyoblast cells［J］.PLoS One，2014，9（4）：e96220.

［7］Geserick P，Wang J，Leverkus M，et al.The ratio of Mcl-1 and Noxa determines ABT737 resistance in squamous cell carcinoma of the skin［J］.Cell Death Dis，2015，6（34）：e1673.

［8］Guo J，Huang X，Yang H，et al.Celastrol Induces Autophagy by Targeting AR/miR-101 in Prostate Cancer Cells［J］. PLoS One，2015，10（10）：e0140745.

［9］张志强，高体云，许建华，等.雷公藤红素通过活性氧诱导结肠癌细胞SW620凋亡［J］.中国医院药学杂志，2015，35

（17）：1558-1563.

［10］Khaw SL，Huang DC，Roberts AW.Overcoming blocks in apoptosis with BH3-mimetic therapy in haematological malignancies［J］.Pathology，2011，43（6）：525-535.

［11］Bodur C，Basaga H.Bcl-2 inhibitors:emerging drugs in cancer therapy［J］.Curr Med Chem，2012，19（12）：1804-1820.

［12］Kremer KN，Peterson KL，Hedin KE，et al.CXCR4 chemokine receptor signaling induces apoptosis in acute myeloid leukemia cells via regulation of the Bcl-2 family members Bcl-w，Noxa，and Bak［J］.J Biol Chem，2013，288（32）：22899-22914.

［13］Choi YM，Kim HK，Choi S，et al.Mechanism of Cisplatin-Induced Cytotoxicity Is Correlated to Impaired Metabolism Due to Mitochondrial ROS Generation［J］.PLoS One，2015，10（8）：e0135083.

［14］Lieber J，Armeanu-Ebinger S，Fuchs J.The role of BH3-mimetic drugs in the treatment of pediatric hepatoblastoma［J］.Int J Mol Sci，2015，16（2）：4190-4208.

（收稿：2015-11-13修回：2016-02-26）

An Active Component of Chinese Traditional Medicine Celastrol Reverses the Cisplatin-resistance of Cervical Cancer

SUN Juping1,JIANG Kai2.1 Clinical Laboratory,the Second Affiliated Hospital of Zhejiang ChineseMedicineUniversity,Hangzhou(310005),China;2ClinicalLaboratory,TongdeHospitalofZhejiangProvince, Hangzhou(310012),China

ObjectiveTo investigate the effect traditionl Chinese medicine celastrol on reversing the cisplatinresistance in cervical cancer cell line Hela/R and the underlying mechanism.MethodsThe cisplatin-resistant Hela/R cell line was established via stepped exposure to cisplatin.MTT assay was performed to explore whether the celastrol can enhance the cytotoxicity of cisplatin to Hela/R cells.The expression of Bcl-2,Bcl-w and Bcl-xl was evaluated by using western blot analysis.The mitochondrial membrane potential and apoptotic rate of Hela/R was determined by flow cytometry.ResultsThe viability inhibition of Hela and Hela/R cells treated with cisplatin was as follows：18.6%±1.5%（Hela）and 1.9%±1.0%（Hela/R）in 1μmol/L cisplatin group;23.9%±2.4%（Hela）and 3.1%±1.2%（Hela/R）in 2μmol/L cisplatin group;47.8%±3.9%（Hela）and 6.8%±1.5%（Hela/R）in 4μmol/L cisplatin group;63.4%±5.4%（Hela）and 11.6%±1.8%（Hela/R）in 8μmol/L cisplatin group;72.7%±5.9%（Hela）and 20.4%± 2.0%（Hela/R）in 16μmol/L cisplatin group;85.7%±6.7%（Hela）and 41.2%±3.3%（Hela/R）in 32μmol/L cisplatin group;91.8%±7.9%（Hela）and 55.8%±4.3%（Hela/R）in 64μmol/L cisplatin group;significant differences were found between two groups（all P＜0.05）.The viability inhibition of Hela/R cells treated with celastrol plus cisplatinwas as follows：6.6%±1.1%in 2μmol/L celastrol group;12.4%±1.2%in 10μmol/L cisplatin group;27.8%±1.9%in 20μmol/L cisplatin group;45.2%±3.1%in 40μmol/L cisplatin group;57.2%±3.9%in 10μmol/L cisplatin+celastrol group;71.45±5.1%in 20μmol/L cisplatin+celastrol group;84.8%±6.8%in 40μmol/L cisplatin+celastrol group;the viability inhibition was better in celastrol plus cisplatin groups than that in cisplatin single groups（all P＜0.05）.The level of Bcl-w/β-actin in Hela/R cells was higher than that in Hela cells（70.9±4.9 vs 22.1±1.3,P＜0.05）;the level of Bcl-2/β-actin and Bcl-xl/β-actin was not different between Hela cells and Hela/R cells（P＞0.05）.Compared with control group,celastrol inhibited the expression of Bcl-w/β-actin in Hela/R cells（29.3±2.6 vs 68.9±4.5,P＜0.05）.Celastrol significantly enhanced the damage of mitochondrial membrane potential induced by cisplatin in Hela/R,leading to the release of cytochrome C and the induction of apoptosis.ConclusionCelastrol enhances the cytotoxicity of cisplatin to Hela/R cells via inhibiting the function of Bcl-w,promoting the activity of pro-apoptotic proteins,resulting in the activity of mitochondria-related apoptosis in cisplatin-resistant cervical cancer cells.

drug-resistant cervical cancer cell line;cisplatin;Hela/R;celastrol;Bcl-w;mitochondria;apoptosis

1浙江中医药大学附属第二医院检验科（杭州310005）；2浙江省立同德医院检验科（杭州310012）

姜凯，Tel：15382362622；E-mail：wzjiangkai@163.com