大孔树脂富集川芎中洋川芎内酯Ⅰ的工艺优选

凌运妮 金露薇 魏元锋 钱帅 高缘 张建军

摘要：目的 优选大孔树脂富集川芎中的苯酞类活性成分洋川芎内酯Ⅰ（Senkyunolide Ⅰ，SⅠ）的工艺条件。方法 综合静态和动态吸附及解吸试验，筛选合适的大孔树脂；以产物回收率、纯度等为指标，优化树脂对SⅠ富集的工艺参数。结果 筛选的6种大孔树脂中，HPD100树脂对SⅠ有较好富集作用。具体工艺参数为：上样浓度1 g原药材/mL，上样量3 mL/g湿树脂，静态吸附时间2 h，树脂床径高比1∶6，以水洗脱至洗脱液近无色后，进而用6倍树脂床体积的40%乙醇（V/V）进行解吸附，洗脱流速为2～4倍树脂床体积/h，收集洗脱液。在优选的工艺条件下，所得产物中SⅠ含量可达8.0%，比处理前提高了13.3倍，回收率为72%。结论 本研究建立的大孔树脂法对SⅠ有较理想的富集效果，为其进一步分离、制备奠定了良好基础。

关键词：大孔树脂；川芎；洋川芎内酯Ⅰ；富集

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.024

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）08-0090-05

川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong hort.的干燥根茎，有活血行气、祛风止痛等功效，主要用于月经不调、经闭痛经、癥瘕腹痛、胸胁刺痛、跌仆肿痛、头痛、风湿痹痛等病症的治疗[1]。川芎中含多类化学成分，如苯酞类、萜烯类、有机酸及其酯、生物碱、多糖等[2]。其中苯酞类成分的抗惊厥、抗血栓形成、降低血液黏稠度、调节心脏功能、防止脑缺血、镇静和催眠等功效均已得到证实，其功效与川芎的活血行气、祛风止痛功效密切相关，故其为川芎的主要活性成分[3]。近年来研究发现，洋川芎内酯Ⅰ（Senkyunolide Ⅰ，SⅠ）为川芎中重要的苯酞类活性化合物，该成分具有较强的抗氧化、抗凋亡、抗大鼠脑缺血再灌注损伤等作用[4]。我们的前期研究也表明，该成分具有优良的体外稳定性及体内药动学特征，口服既可吸收入血又可入脑，具备较好的开发价值[5]。但由于该成分在川芎中的含量相对较低，从植物中提取、制备时有必要首先对其进行富集，因此，本研究探索一种有效的大孔吸附树脂富集SⅠ方法，为该类成分进一步开发研究奠定基础。

1 仪器与试药

EYELA旋转蒸发仪N-1100（上海爱明仪器有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；SHIMADZU高效液相色谱仪（LC-2010C HT），配备DAD二极管阵列检测器、四元泵、自动进样器、LC-solution色谱工作站。

川芎药材购于上海泰坤堂中医院（产地云南，批号20121028），经中国药科大学天然药物实验中心王龙老师鉴定为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎；SⅠ对照品（批号140226，纯度HPLC≥98%），成都克洛玛生物科技有限公司；AB-8、HPD300、X-5、DM130大孔树脂，安徽三星科技有限公司；D101大孔树脂，上海蓝季科技发展有限公司；HPD100大孔树脂，郑州勤实科技有限公司；甲醇为色谱纯，水为自制minipore超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 树脂预处理

将市售新树脂按说明书预处理，最后保存于蒸馏水中备用（用时抽滤，并用滤纸吸干树脂颗粒表面水分）。

2.2 上样液的制备

川芎根茎粗粉800 g，用10倍量50%乙醇加热回流提取2 次，每次2 h，合并提取液，过滤，减压回收溶剂至干，得川芎干浸膏。称取干浸膏适量，加蒸馏水溶解，稀释成每1 mL含所需原药材含量的溶液。

2.3 含量测定方法的建立

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil ODS2 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流动相：甲醇（A）-1%醋酸（B），梯度洗脱（0～35 min，5%～35%A；35～50 min，35%～80%A；50～60 min，80%A；60～65 min，80%～5%A）；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；检测波长：270 nm；进样量：20 ?L。

2.3.2 对照品贮备液的制备 精密称取经五氧化二磷干燥过夜的SⅠ对照品55.5 mg，置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制备得到1.11 mg/mL对照品贮备液。

2.3.3 标准曲线的制备 精密量取上述对照品贮备液适量至容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成浓度分别为333、111、55.5、22.2、5.55、2.22、0.555 ?g /mL的对照品溶液，按上述色谱条件测定。以对照品浓度（?g/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得线性回归方程Y=62 545X-16 101（r=0.999 9），结果表明SⅠ在0.555～333 ?g/mL范围内与峰面积呈线性关系良好。

2.3.4 测定法 在上述色谱条件下，方法的精密度、稳定性、回收率等良好。精密吸取待测液适量，用50%乙醇适当稀释，0.45 ?m微孔滤膜过滤，取续滤液，进样测定，根据标准曲线计算SⅠ含量。

2.4 树脂筛选

2.4.1 静态吸附-解吸试验 称取按“2.1”项下方法处理并抽滤至干（不滴水）的AB-8、HPD300、DM130、X-5、HPD100、D101大孔树脂各2.00 g，分别加入上样液30 mL（原药材含量为150 mg/mL，SⅠ含量为226.73 ?g/mL），静态吸附4 h后过滤，滤液用50%乙醇适当稀释，进样检测，计算吸附率[（吸附前样品液中SⅠ总量-吸附后残液中SⅠ总量）÷吸附前样品液中SⅠ总量×100%]。上述静态吸附试验后的树脂，分别加50%乙醇50 mL，振荡解吸6 h，取样测定，计算解吸率（解吸液体积×解吸液SⅠ浓度÷吸附在树脂上的SⅠ总量×100%）。结果见表1。可见，6种大孔树脂对SⅠ的吸附与解吸性能有明显差别。吸附能力由大到小依次为HPD100>HPD300>X-5>DM130>D101>AB-8，解吸能力由大到小依次为HPD300>D101>HPD100>X-5>DM130>AB-8，其中HPD300、HPD100大孔树脂对SⅠ的吸附率和解吸率均较高。

2.4.2 动态吸附-解吸试验 根据静态试验结果对初步筛选出的2种树脂HPD300和HPD100采用动态解析试验进一步优选。分别取上述2种树脂各5.00 g，湿法装柱（1.2 cm×40 cm），各量取上样液（1 g原药材/mL）8 mL，上样吸附4 h。用4倍树脂床体积（BV）蒸馏水洗脱（流速2 BV/h），收集洗脱液，液相检测，计算吸附率。再以6 BV 50%乙醇洗脱（流速1 BV/h），每1 BV收集1次，进样测定，结果见图1。可见，HPD100和HPD300大孔树脂对SⅠ的吸附率相似，均达98%。在同等操作条件下，HPD100对SⅠ的解吸性能略优于HPD300树脂，且目标成分SⅠ主要集中在前4 BV，故选用HPD100树脂。

2.5 富集工艺参数考察

2.5.1 上样浓度 吸取上样液（2 g原药材/mL）各2 mL，分别加入蒸馏水0、1、2、3、4、8、16 mL，摇匀，即得含原药材2000、1333、1000、800、667、400、222 mg/mL的上样溶液，分别置7个锥形瓶中，各加HPD100大孔树脂2.00 g，静态吸附3 h，时时振摇，样品液处理后进样分析，结果见图2。可见，上样液浓度对HPD100树脂吸附SⅠ影响不大，但对解吸率有较大影响。上样浓度为1000 mg原药材/mL时，有最大解吸率，可达90.8%，故最佳上样浓度为1000 mg原药材/mL。

2.5.2 上样体积 称取HPD100大孔树脂各1.00 g，置于5个50 mL烧杯中，精密吸取上样液（原药材含量为1 g/mL，SⅠ含量为1511.5 ?g/mL）各1、2、3、4、5 mL上样，静置吸附4 h，用适量蒸馏水洗涤，各加50%乙醇50 mL解吸3 h，进样检测，计算回收率（解吸液体积×解吸液中SⅠ浓度÷吸附前样品液中SⅠ总量×100%）。结果见图3。可见，随着上样体积增加，SⅠ回收率降低，上样体积在3 mL以下时，SⅠ回收率达80%以上。综合考虑HPD100树脂的利用效率及SⅠ回收率，选择上样体积为3 mL/g树脂。

2.5.3 吸附时间 称取HPD100树脂各5.00 g，湿法装柱，上样，分别静置吸附0.5、1、2、4 h，水洗除杂；用6 BV 50%乙醇洗脱（流速3 BV/h），分别收集洗脱液，进样测定，结果见图4。可见，吸附时间在2 h时，已达较高回收率（>80%），故确定吸附时间为2 h。

2.5.4 洗脱溶剂乙醇浓度 称取HPD100树脂40 g，加入50 mL上样液（0.5 g原药材/mL），吸附6 h，抽滤至近干，各取3 g，置于5个锥形瓶中，依次加入10%、20%、30%、40%、50%乙醇各50 mL，振荡解吸3 h后进样测定，结果见图5。当乙醇浓度为40%（V/V）时，SⅠ浓度即达平台，且随乙醇浓度增大，更多杂质亦会同时被洗脱下来，导致产物中SⅠ纯度降低，故最佳乙醇浓度为40%。

2.5.5 径高比 取树脂装柱，使径高比分别为1∶3、1∶6、1∶9、1∶13，上样吸附3 h，水洗脱后以6 BV 40%乙醇解吸（流速3 BV/h），收集解吸液，测定，计算回收率，结果见图6。可知最佳径高比为1∶6。

2.5.6 洗脱体积 取上述已吸附饱和的HPD100树脂5.00 g，湿法装柱。8 BV蒸馏水除杂，流速2.5 BV/h，弃去，换40%乙醇洗脱，流速1 BV/h。每1 BV流出液收集1次，进样测定，结果见图7。可见，SⅠ浓度峰值出现在3 BV，6 BV时已基本洗脱完全。故为节省洗脱溶剂及洗脱时间，仅收集前6 BV洗脱液即可。

2.5.7 洗脱流速 称取“2.5.4”项下树脂各5 g，湿法装柱，40%乙醇洗脱，流速分别为1、2、4、6 BV/h，共洗脱6 BV，分别收集洗脱液，在上述色谱条件下测定，结果见图8。可见，洗脱流速越慢，SⅠ的回收率越高，为兼顾回收率及时间效率，选择洗脱流速为2～4 BV/h。

2.6 验证试验

按上述试验确定的最佳工艺处理川芎提取物样品，取按“2.2”项下方法制得的川芎醇提物稀释液（原药材含量为1 g/mL，SⅠ含量为1511.5 ?g/mL），总上样量为50 mL，上HPD100大孔树脂柱，树脂总用量为150 g湿树脂，静置吸附2 h，水洗4 BV，收集洗脱液，减压回收溶剂，得干浸膏。然后依次用10%、40%、70%、90%乙醇溶液各洗脱6 BV，分别收集洗脱液，减压回收溶剂，得干浸膏。称取上述各部位干浸膏适量，置100 mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成各含原药材30 mg/mL的川芎供试品溶液。分别用菊形滤纸过滤，取续滤液，过0.45 ?m微孔滤膜，取续滤液，作为供试品溶液，测定含量。

结果在最佳工艺条件下，川芎中SⅠ得到有效富集。其中，川芎醇提物、水洗部位及10%、40%、70%、90%乙醇部位干浸膏中的SⅠ含量分别为0.6%、0.01%、0.02%、8.0%、0.9%、0.7%，说明上述洗脱条件合理可行，川芎提取物经HPD100树脂按上述最佳工艺条件处理后，苯肽类活性成分SⅠ得到了有效富集，富集后产物中SⅠ含量达到8.0%，是处理前的13.3倍，回收率为72%，且40%乙醇部位是富集SⅠ的目标部位。故最佳工艺参数为：上样浓度1 g原药材/mL，上样量3 mL/g湿树脂，静态吸附时间2 h，树脂床径高比1∶6，以水洗脱至洗脱液近无色后，用6 BV 40%乙醇（V/V）解吸附，洗脱流速2～4 BV/h，收集洗脱液，减压回收溶剂，可得其干浸膏。

3 讨论

大孔树脂是选择性有机高聚吸附剂，具有吸附快、解吸快、吸附容量大、易于再生、使用寿命长等优点，近年来已广泛应用于天然产物的纯化。现有文献报道多为川芎酚酸类成分的研究[6-8]，而相关文献显示，苯酞类成分是川芎药理药效发挥的主要成分，SⅠ为既入血又入脑的成分[4-5]，应用大孔树脂对苯酞类成分纯化工艺方面的研究较为少见。由于川芎所含化学成分复杂，除微量SⅠ外还含有大量生物碱等，导致川芎苯酞类成分难以分离纯化。目前多采用反相高效液相色谱法对SⅠ进行富集，但该方法操作复杂，成本高昂，不适用于大工业生产。而采用大孔树脂富集SⅠ，方法简便、安全、成本低廉，大幅提高了SⅠ的纯度，为川芎苯酞类成分的产业化生产提供了试验依据。

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