刺山柑总生物碱对系统性硬皮病小鼠血清白细胞介素—4、白细胞介素—13和干扰素—γ的影响

何承辉 康小龙 刘晶 卢军

摘要：目的 观察刺山柑总生物碱对系统性硬皮病（SSc）小鼠血清白细胞介素（IL）-4、IL-13和干扰素-γ（IFN-γ）水平的影响，探讨其治疗SSc组织纤维化的作用机制。方法 BALB/c小鼠背部注射盐酸博莱霉素建立SSc模型。将90只小鼠随机分为对照组、模型组、阳性药组和刺山柑总生物碱低、中、高剂量组。刺山柑总生物碱各剂量组小鼠背部分别外敷相应剂量刺山柑总生物碱乳膏，阳性药组给予青霉胺药液灌胃，对照组和模型组背部外敷不含药基质，1次/d，连续60 d。末次给药后，ELISA检测小鼠血清IL-4、IL-13和IFN-γ含量。结果 与模型组比较，刺山柑总生物碱中、高剂量组小鼠血清IL-4含量降低（P<0.01），刺山柑总生物碱高剂量组小鼠血清IFN-γ含量升高（P<0.01），刺山柑总生物碱各剂量组小鼠血清IL-13含量无明显变化。结论 刺山柑总生物碱可能通过调节小鼠SSc IL-4异常表达，调节IL-4/IFN-γ失衡，改善SSc组织纤维化。

关键词：刺山柑总生物碱；系统性硬皮病；白细胞介素-4；干扰素-γ；白细胞介素-13；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.020

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）08-0077-03

系统性硬皮病（systemic sclerosis，SSc）是一种

以皮肤和内脏器官纤维化、免疫异常及血管病变为特征的结缔组织病。刺山柑Capparis spinosa L.为白花菜科Capparaceae山柑属Capparis L.植物，系维吾尔医习用药材之一，其性味辛苦温，具有祛风散寒、除湿、消肿止痛、扩张血管的功效。有研究表明，刺山柑乙醇提取物可抑制SSc患者成纤维细胞增殖及Ⅰ型胶原的合成[1]；刺山柑鲜果75%乙醇调制的糊膏以及刺山柑流浸膏均能显著抑制硬皮病模型小鼠的真皮增厚、胶原沉积[2]。本课题组前期研究表明，刺山柑总生物碱可通过调节小鼠基质金属蛋白酶及其抑制剂失衡，减少Ⅳ型胶原合成，改善SSc组织纤维化[3]。本实验采用BALB/c小鼠背部注射盐酸博莱霉素建立SSc模型，观察刺山柑总生物碱对SSc小鼠血清白细胞介素（IL）-4、IL-13和干扰素-γ（IFN-γ）水平的影响，探讨其治疗SSc组织纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

8周龄清洁级BALB/c小鼠90只，体质量18～24 g，新疆实验动物研究中心，合格证号SCXK（新）2003-0002。饲养于清洁级环境，正常饮食饮水。

1.2 药物及制备

刺山柑药材购自新疆麦迪森维药有限公司饮片厂，经新疆药物研究所何江研究员鉴定为正品。刺山柑总生物碱乳膏制备方法：将刺山柑总生物碱与基质混匀，水浴加热至90 ℃使熔融，作为油相；甘油与浓缩液混合于水浴加热至90 ℃，作为水相；十二烷基硫酸钠、对羟基苯甲酸乙酯溶于适量水中，于水浴加热使溶解，作为乳化剂；当油相、水相温度降至85 ℃时，依次将水相和乳化剂加入油相中，至乳化完全。盐酸博莱霉素粉针剂，日本化药株式会社，批号430312；青霉胺片，上海信谊药厂，批号052130503。

1.3 主要试剂与仪器

小鼠IL-4、IFN-γ ELISA试剂盒（美国R&D;公司），小鼠IL-13 ELISA试剂盒（上海江莱生物科技公司）。酶标仪，美国赛默飞世尔科技公司。

1.4 分组、造模及给药

实验小鼠随机分为对照组、模型组、阳性药组和刺山柑总生物碱低、中、高剂量组，每组15只。实验前用剃毛刀将背部毛剃除。采用皮下注射盐酸博莱霉素粉针剂300 μg/mL制备SSc小鼠模型[4]，每日1次，每次0.1 mL，共4周，观察小鼠背部注射部位皮肤是否出现皮肤增厚、弹性变差等变化。4周后，刺山柑总生物碱低、中、高剂量组小鼠背部分别外敷225、450、900 mg/kg刺山柑总生物碱乳膏，阳性药组予125 mg/kg青霉胺药液灌胃，对照组和模型组背部外敷不含药基质。1次/d，连续60 d。

1.5 小鼠血清白细胞介素-4、白细胞介素-13和干扰素-γ含量测定

末次给药后4 h，小鼠摘除眼球取血，4000 r/min离心10 min，分离血清，ELISA检测血清IL-4、IFN-γ和IL-13含量，严格按试剂盒说明书进行操作。

1.6 统计学方法

采用SPSS11.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 刺山柑总生物碱对模型小鼠血清白细胞介素-4和干扰素-γ含量的影响

与对照组比较，模型组小鼠血清IL-4含量明显升高，IFN-γ含量明显降低，IL-4/IFN-γ比值明显上升（P<0.01）；与模型组比较，刺山柑总生物碱中、高剂量组和阳性药组小鼠血清IL-4含量明显降低，IL-4/IFN-γ比值明显下降（P<0.05，P<0.01）；刺山柑总生物碱高剂量组IFN-γ含量明显升高（P<0.01），刺山柑总生物碱中剂量组和阳性药组小鼠IFN-γ水平均较模型组有上升的趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表1。

2.2 刺山柑总生物碱对模型小鼠血清白细胞介素-13含量的影响

与对照组比较，模型组小鼠血清IL-13含量明显升高（P<0.01）；与模型组比较，刺山柑总生物碱各剂量组和阳性药组小鼠血清IL-13含量差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表2。

3 讨论

研究表明，多种细胞因子参与SSc患者成纤维细胞胶原基因的转录调控[5]。在诸多细胞因子中，IFN-γ仅由活化的天然杀伤细胞和辅助T淋巴细胞1（Th1）合成，体外抑制成纤维细胞增殖和胶原合成，抑制纤维化过程的进展，而IL-4则由辅助T淋巴细胞2（Th2）、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞合成，它在外伤及纤维化过程中起重要作用[6]。IL-4可刺激成纤维细胞增殖和胶原生成，细胞间黏附分子、IL-6的表达及趋化作用，它与IFN-γ作用相反，但是与IL-13之间有共同的受体和生物学活性，均能导致基质累积[7]。此外，IL-4还可以活化转化生长因子-β的转录，编码促纤维化因子，影响胶原蛋白启动子的活性[8]。本研究结果显示，模型组小鼠血清IL-4水平明显升高，IFN-γ水平明显降低，IL-4/IFN-γ比值增大，刺山柑总生物碱中、高剂量均可降低小鼠血清IL-4水平，减小IL-4/IFN-γ比值。提示刺山柑总生物碱可能通过调节SSc模型小鼠IL-4异常表达，调节IL-4/IFN-γ失衡，改善SSc组织纤维化。本研究还发现，刺山柑总生物碱仅高剂量能升高IFN-γ水平，低、中剂量和阳性药对IFN-γ水平无明显影响，提示刺山柑总生物碱及阳性药青霉胺可能对IFN-γ的调节作用不明显；另外，刺山柑总生物碱中剂量组及阳性药组小鼠IFN-γ水平均较模型组有上升的趋势，但差异无统计学意义，这可能与实验周期有关，还需进一步研究。

IL-13是多种细胞的免疫调节因子，目前认为它参与很多皮肤病及免疫疾病的发病及转归过程[9]。在SSc早期阶段IL-13可促进纤维组织增生及内皮细胞的增殖。甲皱襞毛细血管镜检查发现，SSc甲皱襞血管内血液淤积、出血、血管扩张。这些改变与血浆中IL-13水平升高相关，表明此种因子不仅参与SSc的免疫反应和硬化过程，而且在严重的微血管损伤中发挥作用[10]。本研究亦发现模型组血清IL-13含量明显升高，刺山柑总生物碱对小鼠血清IL-13含量无明显影响，提示刺山柑总生物碱可能对SSc小鼠血清IL-13的异常升高无影响。

SSc的治疗一直是皮肤科较为棘手的问题，至今仍是困扰医学界的难题，中医药治疗为该病提供了新思路。许多药物如丹参、桃仁等单味中药在临床和实验研究均被证实具有较好的抗纤维化作用[11]。本研究发现刺山柑总生物碱可纠正Th1/Th2细胞平衡向Th2偏移而干预SSc组织纤维化的发生，动物实验的结果为刺山柑总生物碱用于改善SSc组织纤维化提供了实验依据，也为其开发成为新型治疗SSc药物奠定了基础。今后将就刺山柑总生物碱如何调节SSc Th1/Th2细胞失衡展开更深入的研究。

参考文献：

[1] 曹越兰，李欣，王群.槌果藤对硬皮病小鼠模型皮肤硬化抑制作用的实验研究[J].中国中药杂志，2008，33（2）：215-217.

[2] 曹越兰，李欣，郑敏.槌果藤对进行性系统性硬化症患者成纤维细胞增殖和Ⅰ型胶原产生的影响[J].中国中药杂志，2008，33（5）：560-562.

[3] 康小龙，刘晶，何承辉，等.刺山柑总生物碱对系统性硬皮病小鼠基质金属蛋白酶及其抑制剂的影响[J].中国中医药信息杂志，2016，23（3）：51-53.

[4] 沈佚葳，王京，周平.阿维A对硬皮病小鼠的治疗作用及机制研究[J].中国医药导报，2013，10（25）：20-22.

[5] 朱鹭冰，高地，李明.转化生长因子β1、结缔组织生长因子和干扰素-γ对系统性硬化病胶原合成异质性成纤维细胞克隆胶原基因转录的调控[J].中国临床医学，2011，18（4）：415-418.

[6] Sergei P Atamas， Barbara White. Complex cytokine regulation of tissue fibrosis[J]. Life Sciences，2002，72（6）：631-643.

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[8] 何钠，林有坤，刘京平.系统性硬皮病与组织纤维化[J].临床皮肤科杂志，2009，38（8）：546-548.

[9] 毛笑非，孙秋宁.CD8+T细胞在系统性硬皮病组织纤维化中的作用[J]. 生物技术通讯，2014，25（6）：880-883.

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[11] 闫小宁，冯捷，李文彬，等.温阳除痹汤对硬皮病模型小鼠皮肤结缔组织生长因子及Ⅰ型胶原蛋白表达的影响[J].中西医结合学报，2007， 5（5）：526-530.