液相色谱串联质谱法检测液态乳及原料乳中舒巴坦

安　瑜，王慧芳，张敏娟，唐　欣，李　晓，苏京晶

（陕西省产品质量监督检验研究院，陕西西安　710048）

液相色谱串联质谱法检测液态乳及原料乳中舒巴坦

安瑜，王慧芳，张敏娟，唐欣，李晓，苏京晶

（陕西省产品质量监督检验研究院，陕西西安710048）

建立液态乳及原料乳中舒巴坦残留量的液相色谱串联质谱法检测方法。样品经溶剂提取净化后，采用Poroshell 120SB-C18型液相色谱柱分离，以水和甲醇为流动相，进行等度洗脱，采用多反应监测模式，外标法定量。结果表明，舒巴坦测定方法检出限为0.5 μg/kg，线性范围内低、中、高3个添加水平的回收率为81.8%～87.8%，精密度为3.3%～4.4%。该方法具有简便快捷、灵敏度高、结果准确等特点，适用于液态乳及原料乳中舒巴坦的检测。

舒巴坦；液相色谱串联质谱；液态乳；原料乳；检测

畜牧养殖过程中，为了给牲畜防病、防疫会普遍使用抗生素，但是抗生素使用中不规范、滥用的情况较为普遍，导致生鲜乳中抗生素残留超标。人长期食用超过安全限量抗生素的乳制品可产生耐药性，造成人体肠道菌群紊乱，对易感人群更容易产生过敏反应，从而对人身体健康带来危害。生鲜乳抗生素残留一直是乳制品质量安全监管的重点，为了分解生鲜乳中残留的抗生素以逃避监管，市场上出现了在生鲜乳中添加以β-内酰胺酶为主要成分的抗生素分解剂。卫生部在《食品中可能违法添加的非食用物质名单（第2批）》中明确将β-内酰胺酶列入非食用物质禁止在食品中添加，但目前又出现了添加舒巴坦来抑制β-内酰胺酶活性的问题。舒巴坦作为一种β-内酰胺酶抑制剂，一方面会干扰对β-内酰胺酶的检测；另一方面人为添加的舒巴坦残留在乳制品中，会对人身体健康带来危害。目前，还没有标准方法对原料乳及液态乳中舒巴坦残留量进行检测。

目前，国内外有关舒巴坦的检测方法主要包括高效液相色谱法［1］、液相色谱-串联质谱法［2-5］，它们各有优缺点。高效液相色谱法测定方法简单，易于操作，可以较好地对舒巴坦含量进行定量测定，但其仅通过保留时间进行定性，易出现假阳性。而使用气相色谱-串联质谱法时，样品前处理需要进行衍生化反应，操作复杂，回收率低。液相色谱-串联质谱法操作简便、灵敏度高、回收率和重复性良好，可以较好的对舒巴坦进行定性和定量分析，适用于原料乳及液态奶中舒巴坦药物残留的测定。

1　材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

纯牛奶，内蒙古伊利集团产品；调制乳，陕西银桥集团产品；原料乳，陕西百跃集团产品。

舒巴坦标准品（纯度＞99%），德国Dr.ehrenstor-fer gmbh公司产品；甲醇（色谱纯），德国默克公司产品。

6420 Triple Quad LC/MS型液相色谱串联质谱仪、Poroshell 120SB-C18型色谱柱，美国Agilent公司产品；UHP-Ⅲ-20T型超纯水机，成都优越科技有限公司产品；BSA224S型电子天平，北京赛多利斯天平有限公司产品。

1.2方法

1.2.1样品前处理

准确称取样品5.0 g（精确到0.01 g） 于50 mL聚丙烯离心管内，加入20 mL甲醇，振荡提取20 min，于转速6 500 r/min下离心5 min，上清液转移至100 mL鸡心瓶中，在50℃下旋转至干，加入1 mL水溶解，涡旋混匀，转移至2 mL离心管中，于转速15 000 r/min下离心5 min，上清液过0.2 μm滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定。

1.2.2色谱条件

色谱柱：Poroshell120SB-C18型，3.0mm×100mm× 2.7 μm，或性能相当者；柱温为30℃；进样量为5 μL；流动相为水∶甲醇=90∶10，等度洗脱；流速为0.3 mL/min。

1.2.3质谱条件

电离方式：ESI负离子模式；干燥气：氮气，纯度≥99.9%，10 L/min；离子源温度：300℃；采集模式：多重反应监测模式（MRM）。

舒巴坦的质谱参数及保留时间见表1。

表1　舒巴坦的质谱参数及保留时间

2　结果与分析

2.1样品前处理方法的优化

考察了甲醇、0.4%乙酸、乙腈3种提取溶剂的提取回收率及净化效果。结果表明，当采用甲醇为提取溶剂时，质谱的检测效果最好，没有杂峰干扰。舒巴坦的提取回收率比较稳定，均能获得81.5%～85%的回收率。因此，最终选择的提取溶剂为甲醇。

2.2色谱与质谱条件的优化

2.2.1色谱柱的选择

3种色谱柱分离舒巴坦MRM色谱见图1。

选取了 Agilent公司的Poroshell 120SB-C18型、BEH-C18型和SB-C18型3种色谱柱。结果发现，采用SB-C18型色谱柱和BEH-C18型色谱柱时，舒巴坦峰形较差，不利于结果定性及定量分析；采用Poroshell 120SB-C18型色谱柱时，舒巴坦响应值较高，且峰形和保留时间都比较好。因此，最终选择色谱柱为Poroshell120SB-C18型。

图13种色谱柱分离舒巴坦MRM色谱

2.2.2流动相的选择

考察了甲醇和水、乙腈和水作为流动相对检测结果的影响。结果表明，当流动相为甲醇-水溶液体系时，质谱响应值最高，并且能够获得色谱分离效果，色谱峰形也较好。因此，最终选择流动相为甲醇-水溶液（配比为10∶90）。

2.2.3质谱条件的选择

舒巴坦离子MRM色谱及质谱见图2。

舒巴坦的化学结构表明，此化合物进行电喷雾负离子模式扫描。在负离子模式下，舒巴坦产生140.1 m/z和64.1 m/z的特征离子。最终确定舒巴坦的定量离子对为 232.1/140.1 m/z，定性离子对为232.1/64.1 m/z。对质谱锥孔电压和碰撞能量进行了优化，确定了舒巴坦的最佳质谱参数，质谱条件见1.2.3。在选定的质谱参数下，舒巴坦均响应良好。

2.3方法的验证

2.3.1标准曲线和检出限

采用空白基质匹配标准溶液法，得到液态乳中的标准曲线。空白基质溶液，采用1.2.1中所描述的样品前处理方法制得。使用空白基质溶液逐级稀释标准溶液至1.5，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0 μg/L质量浓度范围，在选定的色谱条件和质谱条件下进行测定，得到舒巴坦的线性方程、线性范围、相关系数和检出限。

试验采用空白样品加标法，分别以各定量离子3倍和10倍信噪比（S/N）对应样品中目标化合物的浓度，得到检出限和定量限。

舒巴坦的线性方程、线性范围、相关系数和检出限见表2，空白样品、舒巴坦标准品及加标样品（50 μg/kg）的MRM色谱见图3。

图3　空白样品、舒巴坦标准品及加标样品（50 μg/kg）的MRM色谱

2.3.2方法精密度和回收率

本试验选取3类空白样品（纯牛奶、调制乳、原料乳）加标的方法进行回收率和精密度试验，在空白样品中添加低、中、高3个浓度水平（1.5，5.0，50 μg/kg） 的标准溶液，按照1.2.1描述的方法进行测定，每个添加水平平行测定6次。

舒巴坦在样品中的回收率和精密度见表3。

表3　舒巴坦在样品中的回收率和精密度

试验结果表明，回收率在81.8%～87.8%范围内，精密度（RSD）在3.3%～4.4%范围内，表明该方法回收率良好，数据结果稳定，可以满足实际检测要求。

3　结论

建立了液相色谱串联质谱检测液态乳及原料乳中舒巴坦残留量的方法，该方法具有简便快捷、灵敏度高、结果准确、回收率稳定等特点，适用于液态乳及原料乳中舒巴坦的检测与验证。

［1］刘珊珊，单艺，满朝新，等.高效液相色谱——二极管阵列检测法测定原料乳中的舒巴坦 ［J］.食品工业科技，2012（16）：64-66.

［2］崔向云，常建军，张雪峰，等.UPLC-MS/MS法测定液态乳中舒巴坦残留 ［J］.中国乳品工业，2014（10）：42-43，45.

［3］张立，李娜思，冯峰，等.超高压液相色谱-串联质谱法测定牛奶中的β-内酰胺类抗生素及其酶抑制剂 ［J］.食品安全检测质量学报，2013，6（4）：1 821-1 827.

［4］马晓斐，张敬轩，李挥，等.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定液态奶中克拉维酸和舒巴坦 ［J］.食品科学，2013（6）：257-260.

［5］郭启雷，王浩，杨红梅，等.液相色谱-串联质谱法测定牛奶中舒巴坦和他唑巴坦 ［G］//2009年中国有机质谱年会论文集.北京：中国物理学会质谱分会有机质谱专业委员会，2009.◇

Determination of Sulbactam Content in Milk and Raw Milk by LC-MS/MS Method

AN Yu，WANG Huifang，ZHANG Minjuan，TANG Xin，LI Xiao，SU Jingjing
（Shaanxi Testing Institute of Product Quality Supervision，Xi'an，Shaanxi 710048，China）

To develop a method for determination of sulbactam content in milk and raw milk by using LC-MS/MS.Samples are extracted by solvent extraction and cleaned up before chromatographic separation on a Poroshell 120SB-C18column using a mobile phase consisting of water and methanol by isocratic elution.The dyes are analyzed by LC-MS/MS in multiple reaction monitoring（MRM） mode and quantified by the external standard method.The limits of detection for the dyes varied from 0.5 μg/kg.The average recoveries across high，medium and low spike levels are between 81.8%～87.8%with a relative standard deviation（RSD）in the range of 3.3%～4.4%.The method is simple，rapid，sensitive，accurate and suitable for determination of sulbactam content in milk and raw milk.

sulbactam；LC-MS/MS；milk；raw milk；determination

TS252.7

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.06.042

1671-9646（2016）06b-0052-03

2016-04-21

安瑜（1985— ），女，硕士，工程师，研究方向为食品安全检测技术。