一起猪瘟病毒感染病例的实验室诊断

张　平，贺志昊，龙冬梅，马惠琴，王芸华，王　云（.贵州省毕节市动物疫病预防控制中心，贵州 毕节 55700；.贵州省纳雍县农牧局，贵州 纳雍 553300）

一起猪瘟病毒感染病例的实验室诊断

张平1，贺志昊1，龙冬梅1，马惠琴1，王芸华1，王云2
（1.贵州省毕节市动物疫病预防控制中心，贵州 毕节 551700；2.贵州省纳雍县农牧局，贵州 纳雍 553300）

摘要：2015年11月毕节市纳雍县某猪场3头育肥猪出现体温升高不下，食欲减退，粪便干燥，全身皮肤出血等症状。临床剖检发现肝、脾、肾多器官广泛性出血。采集剖检猪病变组织，提取RNA，利用荧光定量PCR方法检测，结果显示，猪瘟病毒阳性，确诊为猪瘟病毒感染。

关键字：猪瘟；临床症状；实时荧光RT-PCR

猪瘟（Classical Swine Fever，CSF）是由猪瘟病毒引起猪的一种急性、热性、接触性传染病。以发病急、高热稽留和细小血管壁变性引起广泛出血、梗死和坏死等变化为特征。1885年首先在美国发现，以后传播到世界各大洲[1]。中国大部分省都有发生，主要通过直接接触，或由于接触污染的媒介物而发病。消化道、鼻腔黏膜和破裂的皮肤均为感染途径。一年四季都可发生，以春夏多雨季节为多[2-4]。2015年11月毕节市纳雍县某猪场饲养的3头育肥猪，出现，体温升高不下，食欲减退，粪便干燥，全身皮肤出血等症状。临床剖检发现心肝脾肺肾多器官广泛性出血。剖检采集猪脾、肾、肠系膜淋巴结，采用实验室实时荧光RT-PCR诊断技术，最终确诊为猪瘟病毒感染引起。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1病料采集发病猪肝、脾、肾、肠系膜淋巴结放在50％甘油生理盐水溶液中，低温保存送至市动物疫病预防控制中心兽医实验室。

1.1.2主要试剂世纪元亨猪瘟病毒提取试剂盒，猪瘟病毒通用型荧光定量PCR试剂盒。

1.2方法

1.2.1样品的处理分别从猪肝、脾、肾、肠系膜淋巴结取约1 g组织，用手术剪剪碎混匀后取0.2 g于研磨器中研磨，加入1.5 ml生理盐水，研磨均匀后离心取100 μl上清液于灭菌离心管中。

1.2.2总RNA提取按照猪瘟病毒提取试剂盒说明书进行。

1.2.3实时荧光RP-PCR检测反应采用20 μl体系，反应体系为：无菌无核酸水2.7 μl，RT-PCR反应液10 μl，酶混合液0.4 μl，荧光探针1.9 μl，RNA模板5 μl。反应条件为：45℃15 min，95℃1 min；95℃5 s，60℃35 s，在每个循环第二步收集FAM荧光信号，共40循环（报告基因“FAM”，淬灭基团“NONE”）。

2　试验结果

2.1临床症状

病猪极度消瘦，被毛粗乱，精神沉郁，体温升高，眼角可见分泌物，大便干燥且恶臭，部分猪只四肢、耳后出现出血斑症状。

2.2剖检症状

对病死猪只剖检可见全身性出血，脾脏明显梗死，肝脏、肺脏表面有坏死灶，肾脏水肿，皮肤出现紫斑，膀胱黏膜中有小点出血，肠坏死，肠系膜淋巴结肿胀。

2.3实时荧光RT-PCR试验结果

对3份组织总RNA进行实时荧光RT-PCR检测，结果显示，3份样品均为阳性（见图2）。

由图2可知病死猪3份组织样品RNA均呈现出特异性扩增曲线。根据试剂盒说明书，CT值在25.3172～29.2240范围。根据说明书结果判定CT＜30且呈现特异性扩增曲线，判定三份样品均为CSF阳性。

图1病死猪剖检病变

图2 CSF实时荧光RT-PCR检测结果A1：阳性对照；C1：阴性对照；B1/D1/H1：待检样品

3　讨论

猪瘟一直是感染率、发病率、死亡率都很高的传染病，一旦发生会给养猪业带来很大损失，因此猪瘟的预防及诊断问题一直备受世界各国关注[5,9]。近年来猪瘟的流行和发病特点已转变为以非典型猪瘟为主的流行形势，在临床以及剖检上出现不同于典型猪瘟的特征性病变，给猪瘟临床诊断带来极大困难，开展实验室确诊成为一种准确、方便的诊断方法[6,7]。实时荧光RT-PCR方法，在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。具有操作简单，特异性强，重复性好等特点，已然成为实验室检测动物疫病的主要手段[8,10,11,12]。相信随着分子生物学技术的不断发展，猪瘟病毒检测技术将更灵敏、更特异、更快速、通量更大，检测猪瘟病毒手段将更丰富、更高效，从而有利于开展猪瘟的检测工作。

本实验采用分子生物学技术对3头临床猪瘟症状不典型的育肥猪进行实时荧光RT-PCR方法的检测，确诊了该次疫病由猪瘟病毒引起。为今后实验室确诊猪瘟病毒引起非典型猪瘟提供科学依据。

参考文献：

[1]蔡宝祥.实用家畜传染病学[M].上海：上海科学技术出版社,1989.

[2]姚文生,范学政,王琴,等.我国猪瘟流行现状与防控措施建议[J].中国兽药杂志,2011,45(9):44-47.

[3]王娟萍,姚敬明,吴忻,等.规模化种猪场猪瘟免疫情况调研[J].中国畜牧兽医,2012,39(1):184-187.

[4]王琴,范学政,赵启祖,等.猪瘟防控技术研究进展[J].中国兽药杂志,2012,46(9):58-61.

[5]陈甜甜,程福亮,梁瑾,等.猪瘟和猪蓝耳病病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国生物制品学杂志,2013(3):425-429.

[6]刘建,汤德元,李春燕,等.我国猪瘟流行新趋势与防控措施[J].中国猪业,2013,8(2):37-39.

[7]石顺利.检测猪瘟病毒实时荧光定量PCR方法的研究[D].内蒙古农业大学,2014.

[8]李娇,沈志强,祖立闯.猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法研究进展[J].动物医学进展,2012,33(5):89-93.

[9]高顺.浅谈猪瘟病毒[J].畜牧兽医科技信息,2015(10):89-89.

[10]刘坤,兰邹然,姜平.猪瘟病毒分子生物学及检测技术研究进展[J].动物医学进展,2012,33(10):99-104.

[11]Moennig V，Becher P，Beer M.Classical swine fever.[J].Australian Veterinary Journal，2013，135(2):167-174.

[12]Huang C,Chien M S,Lin G J.Yeast expressed classical Swine fever virus glycoprotein E2 and use thereof:US，US 20140099338 A1[P].2014.

（编辑：高真贞）

中图分类号：S852.65+1

文献标识码：B

文章编号：1006-799X(2016)04-0092-02

作者简介：张平（1988-），女，安徽阜阳人，主要从事兽医实验室检测工作。