昆虫病原线虫Oscheius myriophila共生细菌菌株B1的分离与鉴定

刘 径，张珂恒，曾永三



昆虫病原线虫Oscheius myriophila共生细菌菌株B1的分离与鉴定

刘 径，张珂恒，曾永三

（仲恺农业工程学院植物保护系，广东 广州510225）

摘 要：从昆虫病原线虫（Oscheius myriophila）华农种群HN体内分离得到1株共生细菌B1。该菌株在NA培养基上形成的菌落为圆形，白色，表面光滑，不透明，隆起，边缘整齐；革兰氏阴性，短杆状，单鞭毛，有荧光。Biolog检测结果显示B1为沙雷氏菌（Serratia sp.）；用引物27F/1492R进行 PCR 扩增，得到B1的16S rDNA扩增产物大小为 1 445 bp。Blast搜寻和比对结果表明，该菌株16S rDNA序列与所选的17个嗜线虫沙雷氏菌（S. nematodiphila）的相似度达97%～100%，并以高置信度（99）与这17个嗜线虫沙雷氏菌种群及4个粘质沙雷氏菌（S. marcescens）种群聚于1个单支系中。综合形态和16S rDNA序列特征以及Biolog检测结果，将共生细菌B1鉴定为嗜线虫沙雷氏菌（Serratia nematodiphila）。

关键词：共生细菌； 昆虫病原线虫 Oscheius myriophila； 16S rDNA；嗜线虫沙雷氏菌

昆虫病原线虫共生菌发现于20世纪60年代，属于肠杆菌科 （Enterobacteriaceae） 细菌。目前已报道的昆虫病原线虫共生菌包括致病杆菌（Xenorhabdus sp.）［1］和光杆状菌（Photorhabdus sp.）［2］及沙雷氏菌（Serratia sp.）［3］，它们分别与斯氏线虫属（Steinernema）和异小杆线虫属（Heterorhabditis）及小杆线虫属（Oscheius 或Rhabditis）共生。共生细菌存在于三龄侵染期线虫的肠道内，在昆虫血腔内繁殖，产生毒素并分解昆虫的营养物质，使其患败血症死亡［4-5］。目前国内外学者已经认识到此类共生细菌是一种抑菌［6］，是具有医药价值［7］的生物资源。在共生细菌的传统分类鉴定中，菌株间形态和生理生化指标上的高度相似性，造成了分类鉴定的困难。近年来，16S rDNA 序列分析在昆虫病原线虫共生细菌分类鉴定上的应用［8-9］，促进了共生细菌的分类和鉴定，已成为细菌系统分类研究中最常用也是最有效的分子标记。我们在近年的昆虫病原线虫调查中，通过大蜡螟诱集得到1个昆虫病原线虫种群，即华农种群（Oscheius myriophila HN），从该线虫中分离得到1株共生细菌菌株（B1）。现结合形态和分子特征以及Biolog分析结果，鉴定了该菌株，以期为该菌株的应用研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 昆虫病原线虫的获得

昆虫病原线虫的诱集、分离和保存采用刘志恒［10］的方法。

1.2共生细菌的分离培养

在无菌操作条件下，在体视镜下挑取昆虫病原线虫接入鉴别培养基（NBTA）平板上，黑暗环境下培养48 h，即可获得共生细菌。NBTA培养基含NB培养基〔牛肉膏3.00 g，蛋白胨 5.0 g，1 000 mL水，氯化三苯基四氮唑（TTC）0.04g，溴麝香百里酚兰（BTB）0.025 g，琼脂粉 12.0g〕，pH 为7.2～7.4。

1.3 共生细菌的纯化和保存

在NBTA培养基平板上获得共生细菌后，挑取单菌落进行2次以上的划线分离培养，并于NA斜面培养基［10］（牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖2.5 g，琼脂18.0 g，水1 000 mL）培养保留备用。采用甘油管冷冻保藏法［11］，即挑取单菌落，无菌条件下接种到适当的培养基中，28℃在振荡培养到对数生长后期，吸取0.8 mL培养液，添加0.2 mL 80% 无菌甘油，混合。直接放到-80℃低温冰箱中保存备用。使用时，可直接从冰箱中取出在平板上划线培养，分离获得单菌落。

1.4 共生细菌的活化培养

将保存的共生细菌菌株B1，在NA培养基上28℃活化培养3 d后，挑取单菌落即初生型菌落用于菌株鉴定。液体培养用NB培养基在28℃条件下振荡培养24 h（大振幅恒温摇床，武汉中科科仪技术发展有限责任公司，HQL150B），获得细菌发酵液。

1.5 共生细菌的形态观察

观察细菌的菌落形态，以及是否产生荧光，并通过染色，在显微镜下观察细菌的形状、鞭毛及革兰氏染色反应［12］。

1.6 共生细菌的Biolog检测

细菌的碳源利用情况通过Biolog微生物自动分析系统检测。Biolog检测方法为MS（i）/C027-C01（Biolog微生物鉴定系统鉴定程序），由广东省微生物分析检测中心完成。

1.7 昆虫病原线虫的分子特征分析

1.7.1 共生细菌DNA的提取 用细菌DNA提取试剂盒（广州东盛生物科技有限公司）提取共生细菌DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。提取的DNA用于PCR扩增或者于-20℃保存备用。

1.7.2 PCR扩增 分别以大肠杆菌（Escherichia coli）16S rDNA的8～27位核苷酸27F（5' AGAG TTTGATCCTGGCTCAG 3'）和1 492～1 472位核苷酸1492R（5' ACGGCTACCTTGTTACGACTT 3'）［13］为正向引物和反向引物，以细菌DNA作为模板进行PCR扩增。在50 μL PCR反应体系中含有：1 μL正向引物，1μL反向引物，20 μL ddH2O，25 μL2×Taq Green Mix DNA聚合酶 （含有TaqDNA聚合酶，dNTPs，Taq酶反应缓冲液、稳定剂和染料，由北京鼎国昌盛生物技术责任有限公司生产），3 μL 细菌 DNA 模板。反应程序［14］为：95℃ 预变性 2 min，94℃ 变性40 s，56℃退火40 s，72℃ 延伸1 min，循环30次，最后 72℃ 延伸10 min。PCR 产物用0.8% 琼脂糖 （0.16 g琼脂糖粉，0.7 μL Gold View，20 μL 1×TBE） 凝胶检测，在0.5×TBE 电泳缓冲液（Tris-base 54.00 g，硼酸27.50 g，EDTA（0.5 mol/L，pH 8.0）20 mL，ddH2O 980 mL）中以电压 2.4 V/cm电泳20 min，采用 Kodak GEL LOGIC 200 IMAGING SYSTEM 凝胶成像系统观察和拍摄。

1.7.3 共生细菌16S rDNA测序及序列分析 将PCR产物由六合华大基因科技股份有限公司测序部纯化后，用3730全自动测序仪（美国ABI公司）进行测序。所得序列及与其高匹配的GenBank中的细菌序列经ClustalW序列比对后，再利用MEGA5.0 软件构建系统发育树，分析待鉴定共生细菌与相关细菌的系统发育关系。

2　结果与分析

2.1 共生细菌形态特征

待鉴定共生细菌B1在NA培养基上28℃黑暗环境下培养48 h后形成圆形单菌落，白色，表面光滑，不透明，隆起，边缘整齐（图1）。在显微镜下观察，该菌为革兰氏阴性，短杆状，单鞭毛，有荧光。

A：单菌落图1 共生细菌（B1）在NA培养基上的菌落

2. 2 Biolog分析

Biolog检测结果显示，本研究共生细菌B1为沙雷氏菌（Serratia sp.），SIM=0.596。

2.3 分子生物学特征

2.3.1 PCR扩增 用引物27F/1492R进行 PCR 扩增，得到共生细菌B1的16S rDNA扩增产物大小为1 445 bp。PCR产物电泳检测结果见图2。

M：DNA Marker；1，2：B1的16S rDNA条带图2 共生细菌（B1）16S rDNA PCR产物电泳检测结果

2.3.2 DNA序列比对 将待鉴定共生细菌B1的16S rDNA序列进行Blast搜寻和比对，结果表明该菌株16S rDNA序列与所选的17个嗜线虫沙雷氏菌（S. nematodiphila）的相似度达97%～100%，有0～8个碱基差异；与GenBank中的4个粘质沙雷氏菌（S. marcescens）的相似度为97%～99%，有9～14个碱基差异；与深红沙雷氏菌（S. rubidaea，AB004751）的相似度为96% ，有50个碱基差异；与沙雷氏菌（S. ureilytica，AJ854062）的相似度也为97% ，有27个碱基差异；与沙雷氏菌（S. odorifera，AF286870）的相似度也为96% ，有46个碱基差异；与沙雷氏菌（S. plymuthica，KJ729609）的相似度也为95%，有57个碱基差异； 与沙雷氏菌（S. proteamaculans，AB334771）的相似度也为95%，有70个碱基差异。

2.3.3 与相近种的分子系统发育关系 从基于16S rDNA序列的系统发育树中可以看出：（1）所选的所有35个沙雷氏菌（Serratia spp.）以高置信度（91%）聚于1个单支系中；（2）本研究共生细菌B1和所选的17个嗜线虫沙雷氏菌（S. nematodiphila）种群及4个粘质沙雷氏菌（S. marcescens）种群以高置信度（99%）聚于1个单支系中，并与S. ureilytica（AJ854062）构成姊妹支系；（3）共生细菌B1和所选的17个嗜线虫沙雷氏菌种群与所选的4个粘质沙雷氏菌种群亲缘关系最近，与同属的S. ureilytica（AJ854062）、S. rubiaea（AB004751）、S. odorifera （AF286870）、S. entomophila （AJ233427）、S. ficaria （AJ233428）种群亲缘关系较近，而与另外6个种（S. plymuthica、S. symbiotica、S. fonticola、S. grimesii、S. quinivorans 和S. proteamaculans）的亲缘关系较远；（4）嗜线虫沙雷氏菌和粘质沙雷氏菌与S. ureilytica 可能存在共同的祖先（图3）。

综合以上形态、Biolog和16S rDNA 序列分析结果，该菌株鉴定为嗜线虫沙雷氏菌（Serratia nematodiphila），是一种隶属于肠杆菌科的细菌。

3 结论与讨论

分子系统发育关系分析表明，本研究共生细菌B1与嗜线虫沙雷氏菌（S. nematodiphila）的相似度高达97%～100% （有0 ～8个碱基差异），与粘质沙雷氏菌（S. marcescens）的亲缘关系最近，相似度达97%～99%（有9～14个碱基差异），但是共生细菌B1与粘质沙雷氏菌在形态和生理特性有较大差异，如前者菌体生单根鞭毛，后者为周生鞭毛；前者菌落为白色，后者为红色。因此，综合形态特征观察、Biolog检测和16S rDNA 序列分析，分离自昆虫病原线虫 Oscheius （Rhabditis） myriophila体的共生细菌菌株B1鉴定为嗜线虫沙雷氏菌S. nematodiphila。这是从昆虫病原线虫 O. myriophila体分离得到该共生细菌的首次报道。

沙雷氏菌中的粘质沙雷氏菌（S. marcescens）是一种已知的昆虫病原。已报道从自然死亡的蝗虫体中分离得到的S. marcescens对蝗虫有致病性［15-16］。Tao等［16-17］报道，由 S. marcescens分泌的一些胞外蛋白例如核酸酶，磷脂酶，蛋白酶，溶血素涉及蝗虫的发病机理。 因而，S. marcescens被认为是蝗虫的一种潜在的生防剂。Tambong［3］从小杆线虫（Rhabditis sp.） 中分离得到 1 个 S. marcescens菌株，并经测定显示其对大蜡螟具有致病性。然而有关嗜线虫沙雷氏菌（S. nematodiphila）及其杀虫活性的研究不多。Zhang等［18］从病虫病原线虫（Heterorhabditidoides chongmingensis，后被重新鉴定为Oscheius chongmingensis）体中分离得到嗜线虫沙雷氏菌（S. nematodiphila），刘敬瑞［19］用大蜡螟初孵幼虫测定了该菌菌株（DZ0503SBS1T）的菌体及其胞外杀虫蛋白粗提物的杀虫活性，结果表明该菌对大蜡螟具有较高的毒力。本研究中的 S. nematodiphila是从通过大蜡螟诱集获得的昆虫病原线虫 O. myriophila 体中分离得到，该菌是否能致死大蜡螟等害虫或病原物及其致病机理还有待于深入研究。

图3 基于16S rDNA序列构建的共生细菌（B1）系统发育树

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（责任编辑 杨贤智）

中图分类号：S476.15

文献标识码：A

文章编号：1004-874X（2016）03-0111-05

收稿日期：2015-10-19

基金项目：广东省科技计划项目（2011B020308010）

作者简介：刘径（1990-），女，在读硕士生，E-mail： 645521113@qq.com

通讯作者：曾永三（1965-），男，博士，教授，E-mail：zys65@163.com

Isolation and identification of a symboiotic bacterial strain （B1）from an entomopathogenic nematode， Oscheius myriophila

LIU Jing，ZHANG Ke-heng，ZENG Yong-san
（Department of Plant Protection， Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225， China）

Abstract：A symbiotic bacterial strain designated as B1 was isolated from an entomopathogenic nematode，Oscheius myriophila HN. The colonies formed on NA medium were round， white， smooth， opaque， convex and entire. The B1 cell is gram-negative， short rod-shaped， mono-flagellum and fluorescent. Biolog assay results showed that B1 belongs to the genus Serratia. The size of PCR amplification segment of B1 16S rDNA by using primers 27F/1492R is 1445 bp. BLAST search and alignment of the 16S rDNA sequence indicated that identities of the studied sequence and the selected 17 ones from S. nematodiphila populations reached 97% -100%， and B1 was clustered into a monophylogenetic clade with these 17 and four S. marcescens populations with high bootstraps （99）. The symbiotic strain B1 was identified as Serratia nematodiphila based on morphological and 16S rDNA sequence characteristics and Biolog test result.

Key words：symbiotic bacteria；entomopathogenic nematode Oscheius myriophila；16S rDNA；Serratia nematodiphila