黄尾鲴不同组织中LDH同工酶的研究

姚桂桂， 刘 凯， 谢 楠， 冯晓宇

(杭州市农业科学研究院，浙江杭州 310024)



黄尾鲴不同组织中LDH同工酶的研究

姚桂桂， 刘 凯， 谢 楠， 冯晓宇

(杭州市农业科学研究院，浙江杭州 310024)

摘要[目的]研究黄尾鲴不同组织的LDH同工酶。[方法]采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和特异性染色方法对黄尾鲴的肝、肾、眼、心4种组织的LDH同工酶进行分析。[结果]酶谱的表达具有明显的组织特异性。酶带由3个基因座位(LDH-A、LDH-B、LDH-C)编码，在4种组织中共检测到14条带，其中，心和肾7条带，眼6条带，肝14条带。在PAGE胶趋向阴极侧检测到6条肝脏组织所特有的LDH-C基因编码带。在各组织LDH酶带表达活性上，心中LDH-2、LDH-3和LDH-5表达占优势，肾中LDH-2、LDH-7和LDH-3表达占优势，肝中LDH-13、LDH-9和LDH-12表达占优势，眼中LDH-5、LDH-2和LDH-7表达占优势。[结论]该研究为丰富黄尾鲴遗传学基础研究、遗传育种种质标准的建立和种群生化遗传结构分析提供科学依据。

关键词黄尾鲴；同工酶；乳酸脱氢酶

黄尾鲴(Xenocyprisdavidi)隶属于鲤形目(Cypriniformes)鲤科(cyprinidae)鲴亚科(Xenocyprininae)鲴属(Xenocypris)，俗称黄尾巴、黄片、黄姑子、黄瓜鱼等，广泛分布于我国黄河流域以南各水系，在江河、湖泊、水库中均有分布，属底栖型鱼类，主要以底层藻类、腐殖质等为食[1]。由于其底栖刮食性的特点，黄尾鲴对水体生态环境改善、水质改良具有较好的促进作用，是目前人工增殖放流、池塘混养的理想品种。另因其肉质细腻、味道鲜美，黄尾鲴也是较受消费者欢迎的特色鱼类品种之一。目前，黄尾鲴规模化苗种繁育及养殖技术已较成熟，人工养殖已形成一定规模，但对于黄尾鲴同工酶的研究鲜见报道。

同工酶是由生物体内基因组编码，催化某类生化反应，而本身分子结构有所不同的一组酶，它把宏观的遗传现象联系到微观的分子水平，从基因的产物认识基因的存在及表达，通过研究同工酶的结构、功能、调控，了解从物种的基因到物种的性状的中间过程[2]。目前，同工酶技术已被广泛应用于遗传系统进化[3]、个体发育[4]、杂交育种[5]以及病理和生理[6]等方面的研究。笔者对黄尾鲴4种不同组织的LDH同工酶进行研究，旨在了解其生理生化等生物学特性，为丰富黄尾鲴遗传学基础研究、遗传育种种质标准的建立和种群生化遗传结构分析提供科学依据。

1材料方法

1.1试验材料试验用鱼为杭州市农业科学研究院保存的采集自钱塘江、福建清流以及湖南醴陵等地的黄尾鲴, 未分雌雄，体重在50～150 g，每2尾制备同工酶混合样品，重复3次。

1.2试验方法

1.2.1同工酶的提取。将鱼解剖，取肝、肾、心、眼等组织，PBS冲洗去除血渍，按体积比1∶4加入提取缓冲液(0.05 mol/L pH 6.8 Tris-HCL缓冲液)，冰上用玻璃匀浆器进行组织匀浆后，转入1.5 mL离心管，4 ℃ 9 755 r/min离心30 min，吸取上清液至新的离心管中，-20 ℃保存。

1.2.2电泳及染色。采用不连续聚丙烯酰胺非变性凝胶垂直电泳，进行乳酸脱氢酶(LDH)同工酶分析，电泳及染色方法参照国标方法进行[7]。浓缩胶浓度为3.75%，pH 6.8，分离胶浓度为6.5%，pH 8.8。每个加样槽加样5 μL(样品上样液∶5×上样缓冲液=4∶1)，200 V恒压电泳5～6 h。

1.2.3结果记录。凝胶经染色、固定后置Gel DocTMXR+凝胶成像分析系统(美国 BIO-RAD公司)进行拍照及图谱扫描。根据胶片绘制模式图，扫描数据用SPSS 13.0 for Windows 软件进行分析。

1.2.4同工酶命名及分析。同工酶的缩写、基因座位和等位基因的命名基本参照Shakelee等[8]和Whitmore[9]的方法，即以同工酶名称缩写的大写代表酶蛋白，小写代表编码基因。控制同一种酶的不同基因座位据其相对迁移率Rf由大到小依次编号为1、2、3……，酶带分析参考熊全沫[10-11]的方法。

2结果与分析

2.1不同组织LDH同工酶谱的表达特性对黄尾鲴4种组织LDH同工酶的PAGE电泳图谱及其相应的模式图进行分析，结果显示，酶谱的表达具有明显的组织特异性：在4种组织中共检测到 14条带，从阳极端到阴极端依次编号为LDH-1、LDH-2、LDH-3、LDH-4、LDH-5、LDH-6、LDH-7、LDH-8、LDH-9、LDH-10、LDH-11、LDH-12、LDH-13和LDH-14，心和肾7条带，眼6条带，肝14条带，其中，LDH-2、LDH-3、LDH-5、LDH-6和LDH-7在心、肾和眼中均有表达，且各酶带迁移率非常相似，仅不同组织的酶带活性强弱不同。眼中未检测到LDH-8，而在其他组织中均有表达。在PAGE胶趋向阴极侧检测到6条肝所特有的酶带：LDH-9、LDH-10、LDH-11、LDH-12、LDH-13和LDH-14。此外，与其他组织相比，肝中缺失LDH-4酶带，但特有LDH-1酶带。

2.2不同组织LDH同工酶相对百分含量利用凝胶成像分析系统对各组织LDH同工酶进行酶谱扫描及百分比分析，结果见图2和3。由图2和3可知，心中LDH-2、LDH-3和LDH-5表达占优势，肾中LDH-2、LDH-7和LDH-3表达占优势，肝中LDH-13、LDH-9和LDH-12表达占优势，眼中LDH-5、LDH-2和LDH-7表达占优势。对于典型的由A、B 2个亚基组成的4聚体LDH的5条谱带的电泳图，可以对组成A、B亚基的表达优势进行分析，但由于黄尾鲴各组织中LDH均未表现为典型的5谱带的电泳图谱，对亚基分析比较困难。

注：H.心脏; K.肾脏; L.肝脏;E.眼。Note:H, K, L and E present heart, kidney, liver and eyes, respectively.图1　黄尾鲴不同组织LDH同工酶的电泳图及其相应的模式图Fig.1　Electrophoretogram and model graph of LDH isozyme expressed in various tissues of Xenocypris davidi

图2　黄尾鲴不同组织LDH同工酶谱带扫描图Fig.2　The spectral band scan of the LDH isozyme in different tissues of Xenocypris davidi

图3　黄尾鲴不同组织LDH同工酶相对百分含量Fig.3　Relative percentage content of the LDH isozyme in different tissues of Xenocypris davidi

3讨论

3.1黄尾鲴LDH同工酶酶谱分析关于黄尾鲴LDH同工酶的研究已有报道，最早见于朱蓝菲[5]的研究，朱蓝菲[5]研究结果表明，黄尾密鲴的心、肾和晶状体等组织LDH均由3条谱带组成。朱蓝菲等[3]进一步探讨了鲤科鱼类LDH同工酶的表型差异并指出眼(晶状体)的LDH同工酶较稳定，能代表各种鱼的LDH表型。曹丽琴等[12]研究中国鲴亚科鱼类同工酶和骨骼特征及系统演化，结果显示，肝LDH同工酶谱带较多，肾脏、眼睛、脑及心脏等组织均由5条谱带组成。杨品红等[13]研究了与黄尾鲴分类地位相近的细鳞斜颌鲴的LDH同工酶，指出细鳞斜颌鲴脑、肾、心和眼4种组织中LDH同工酶只有3条LDH谱带，而肝中有7条带，肌肉中有1条超显性带。

在该试验过程中发现，黄尾鲴肝、肾及心等组织中LDH同工酶的谱带较多且电泳图谱不稳定，尤其是肝组织的LDH电泳图谱。造成同工酶酶谱差异的原因，一方面可能是由于在同一种鱼不同组织中酶的编码基因(如A和B)不是同时表达，造成组织之间酶谱带数量的不同；另一方面，即使编码基因同时表达，但编码基因活性表现程度不同，或者基因表达后由于各种组织执行不同生理功能，酶受到不同因子的调控，造成各组织间同工酶含量或活性的差异，因而形成酶谱带强弱的差异[14]。此外，杂蛋白的存在及样品制备、保存等问题，也是造成同工酶酶谱差异的原因。相对于其他组织，眼(晶状体) LDH的谱带则相对较稳定，多次重复试验结果未见差异。但眼(晶状体)LDH同工酶谱带不同于已报道文献[3,12]由5条谱带组成，是由6条谱带组成。试验样品送农业部淡水鱼类种质监督检验测试中心(武汉)复检，结果显示，黄尾鲴眼LDH同工酶谱带由6条谱带组成，且肝、心和肾等组织LDH酶谱与该试验结果基本一致。由此可知，LDH同工酶在各组织中表达稳定性存在差异，且由于样品制备、处理等差异，造成试验结果差异。但相对于其他组织，眼(晶状体) LDH的谱带则相对较稳定，可以作为种质鉴定的特征之一。

3.2黄尾鲴LDH同工酶特异谱带分析鱼类LDH同工酶中常检测到特异带，如粗唇鮠[15]酶谱A3B1处存在一条同分异构体，锦鲤和红鲤[16]的肌肉中LDH-B基因位点出现新的等位基因LDH-B′，但变异最大的是C带。一般认为，C带是由LDH-C或LDH-X[17]编码。C带变异主要体现在3个方面[13]：表达的部位；在PAGE胶中的显带部位；C带表达

条数。该试验中，在PAGE胶趋向阴极侧检测到6条肝所特有的酶带：LDH-9、LDH-10、LDH-11、LDH-12、LDH-13和LDH-14。推测是编码区产生了LDH-C的新等位基因LDH-C′，或者LDH-C和LDH-A或LDH-B形成了杂合四聚体。此外，在黄尾鲴各组织中未发现LDH同工酶酶谱的5条典型酶带，可能是LDH-A或LDH-B产生了同分异构体，其原因有待于进一步研究。

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基金项目2014年农业行业(水产)标准制定。

作者简介姚桂桂 (1983- ), 女,浙江天台人，工程师，硕士，从事水产繁育与养殖研究。

收稿日期2016-04-16

中图分类号S 917

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)15-135-03

Study on LDH Isozyme in Different Tissues ofXenocyprisdavidi

YAO Gui-gui, LIU Kai, XIE Nan et al

(Hangzhou Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou, Zhejiang 310024)

Abstract[Objective] The aim was to study LDH isozyme in different tissues of Xenocypris davidi.[Method] By using vertical polyacrylamide gel electrophoresis and specific dye measures, LDH isozyme in 4 tissues (liver, kidney, eye and heart) of Xenocypris davidi was studied.[Result] The results showed that the electrophoretogram of LDH isozyme patterns exhibited remarkable tissue specificities.14 LDH isozyme bands encoded by LDH-A, LDH-B, LDH-C loci were detected from all the 4 tissues.7 bands were found in heart and kidney, 6 bands were found in eye, and 14 bands were found in liver.6 specific bands encoded by LDH-C were detected on the cathode side of PAGE hectograph within liver.According to activity of LDH isozyme in tissues, LDH-2, LDH-3 and LDH-5 were preponderantly expressing in heart, LDH-2, LDH-7 and LDH-3 were preponderantly expressing in kidney, LDH-13, LDH-9 and LDH-12 were preponderantly expressing in liver, and LDH-5, LDH-2 and LDH-7 were preponderantly expressing in eye.[Conclusion] The study provides a scientific basis for enrichment of genetic basis research, establishment of genetic breeding germplasm standard and analysis of population biochemical genetic structure.

Key wordsXenocypris davidi; Isozyme; Lactate dehydrogenase