款冬花多糖功能饮料的制备及其抗氧化能力测定

李改艳，刘小丹，张琳娜

(1.陕西顺天医药有限公司，西安　710077；2.陕西新民生医药有限公司，西安　710026)



款冬花多糖功能饮料的制备及其抗氧化能力测定

李改艳1，刘小丹1，张琳娜2

(1.陕西顺天医药有限公司，西安710077；2.陕西新民生医药有限公司，西安710026)

摘要：目的研究款冬花多糖功能饮料的最佳制备工艺，并测定其抗氧化能力。方法采用正交实验方法设计功能饮料的制备工艺，用·DPPH试剂测定功能饮料的抗氧化性。结果款冬花多糖功能饮料的最佳配比为款冬花多糖60 g、砂糖8 g、柠檬酸0.24 g和β-环糊精0.2 g，此条件下制备的功能饮料口感良好，易于接受。结论得到一条适用于款冬花多糖功能饮料制备的工艺路线，并测得该多糖功能饮料具有明显的抗氧化性。

关键词：款冬花；多糖；功能饮料；·DPPH抗氧化性

功能饮料是指通过调整饮料中天然营养素的成分和含量比例，以适应某些特殊人群营养需要的饮品，其成分与人体体液相似，饮用后可被迅速吸收，及时补充人体因大量运动出汗所损失的水分和电解质，使体液达到平衡状态。因此，功能饮料成为目前广大人群接受的健康饮品。中药款冬花[1]为菊科植物款冬(FlosFarfarae)的干燥花蕾，主产于陕西、山西、甘肃和河南等地，其花含款冬二醇等甾醇类、芸香苷、金丝桃苷、三萜皂苷、鞣质、蜡、挥发油、菊糖、硬脂酸、棕榈酸甘油酯、酒石酸、苹果酸、转化糖、胆碱和碳氢化合物；其味辛，在中医理论指导下主治咳逆上气善喘、喉痹、肺痿肺痈和吐脓血等疾病；始载于《神农本草经》，为常用中药材之一；具有润肺止咳和化痰平喘之功效。目前，国内外对款冬花的研究主要集中在萜类、黄酮、生物碱、有机酸和精油等化学成分，对多糖类成分的研究相对较少，也鲜见有关款冬花多糖[2]抗氧化性方面的报道。为更好地开发和利用这一药用资源，本实验拟将款冬花多糖开发[3]为一种新型功能饮料，并采用·DPPH试剂法检测款冬花多糖清除自由基的能力，为合理地利用款冬花多糖这一生物活性成分提供依据。

1仪器与试药

1.1仪器UV-265紫外分光光度仪(SB3200DT，日本岛津公司)；BSAL204电子天平(梅特勒托利多仪器有限公司)；HHS112电热恒温水浴锅(江苏省医疗器械厂)；SHZD Ⅲ循环水式多用真空泵(振洲长城科工贸易有限公司)；XMTD电热鼓风干燥箱(北京科伟永鑫实验仪器设备厂)；KQ2100超声清洗器(宁波新艺生物科技股份有限公司)；SHB-B95真空泵(郑州长城科工贸公司)。

1.2试药款冬花；葡萄糖对照品(批号：20140208，天津市滨海科迪化学试剂有限公司)；浓硫酸、邻苯三酚和无水乙醇等试剂均为分析纯(国药集团化学试剂陕西有限公司)；实验用水为纯化水(西安万隆制药股份有限公司)。

2方法

2.1款冬花多糖的提取方法[4-5]取干净、无霉变的生品款冬花蕾，除去枝干和石块等杂物，用清水冲去表面灰尘及泥土后沥干，干燥。用剪刀剪碎款冬花花蕾，浸泡24 h后进行超声提取。

2.2多糖提取单因素结果与分析

2.2.1提取温度对款冬花多糖提取率的影响固定液料比为21 mL·g-1，提取时间为6 h，用3倍体积的无水乙醇沉淀，考察不同的提取温度对多糖提取率的影响。结果显示,当温度分别为25，28，30和32 ℃时，款冬花多糖的提取率依次为5.31%，7.54%，10.61%和9.35%。由此可知，随着温度的升高，多糖提取率增加，在超声提取下30 ℃时达到最高值，之后随温度上升，多糖提取率有下降趋势。其原因可能与多糖本身的稳定性有关，高温提取可能会导致多糖降解，从而引起多糖提取率下降；此外，超声频率对多糖提取也有影响。2.2.2提取时间对款冬花多糖提取率的影响固定液料比为15 mL·g-1、温度为30 ℃，考察不同的提取时间对多糖提取率的影响。结果显示，当时间分别为4，6，8和10 h时对应的款冬多糖提取率依次为5.62%，9.61%，9.83%和8.62% 。由结果数据可知，多糖提取率在4～6 h之间上升比较明显，以后趋于平缓。8 h以后，提取率有了较明显的下降趋势，这可能是随着提取时间的延长，在提取温度达到30 ℃时，多糖出现了降解反应，从而影响了多糖的提取率，因此超声提取时间应控制在6～8 h之间。

2.2.3液料比对款冬花多糖提取率的影响在温度为30 ℃时，提取3次，时间6 h，考察不同的液料比对多糖提取率的影响，结果显示：当液料比分别为15，18，21和24 mL·g-1时，对应的提取率依次为6.65%，9.61%，10.14%和9.553%。通过分析数据可知，液料比在10～20 mL·g-1之间，多糖提取率上升较快，而液料比在21～24 mL·g-1之间呈现明显下降趋势。这可能是因为随着液料比的增加，款冬花花蕾中其他成分的溶出影响了多糖的溶出，因此液料比应定在21 mL·g-1。

2.2.4醇沉体积比对多糖提取率的影响取上述多糖的提取液按照一定比例浓缩，浓缩后的提取液等体积分为4份，分别加入1，2，3和4倍体积的无水乙醇醇沉，静置过夜，抽滤，抽去杂质，得粗多糖，考察不同醇沉体积比对多糖提取率的影响。结果，当醇沉体积比为1.5，2.0，2.5和3.0倍时，款冬花多糖提取率分别为5.38%，8.97%，10.60% 和9.76%，用2.5倍量体积的乙醇醇沉，得到的杂质最多。因此，确定最佳的乙醇用量为多糖浓缩液体积的2.5倍。

2.3款冬花多糖的脱色称取活性炭2 g，置于烘箱中干燥活化，30 min后取出，与款冬花多糖混合进行脱色处理，过滤。

2.4款冬花多糖含量的测定方法将提取液置于90 ℃的水浴锅中蒸发、浓缩9 h，放入烘箱中55 ℃干燥9 h，至款冬花多糖完全干燥。精密称定质量，为5.732 0 g。

款冬花多糖提取率(%)=(款冬花粗多糖质量/款冬花干质量)×100%

2.4.1对照品溶液的制备精密称取在105 ℃条件下干燥至恒质量的葡萄糖对照品0.250 mg，置于250 mL 量瓶中，加蒸馏水溶解，稀释至刻度，定容。

2.4.2标准曲线的制备量取上述溶液10 mL,置于100 mL 量瓶中，稀释至刻度，得到质量浓度为0.1 mg·mL-1的葡萄糖标准溶液。精密量取上述葡萄糖标准溶液0.1，0.2，0.4，0.6和0.8 mL，分别置于10 mL 量瓶中，依次加蒸馏水至10.0 mL，摇匀。分别加入50 mL·L-1的苯酚溶液1.0 mL，再迅速加入5.0 mL浓硫酸，振摇5 min，在沸水浴中静置加热15 min，冷却，空白溶液作对照。在490 nm 处测定吸光度，测得结果：当葡萄糖质量浓度分别为0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg·mL-1时，其吸光度依次为0.230 15，0.292 20，0.424 13，0.556 10，0.686 21和0.804 32。以葡萄糖质量浓度C为横坐标、吸光度A为纵坐标，进行线性回归。得回归方程：Y=0.643 8X+0.000 8(r=0.999 7)。

2.5款冬花多糖功能饮料的调制

2.5.1款冬花多糖饮料的调配以款冬花多糖为主原料，配以蔗糖、柠檬酸和β-环糊精的基础液，在各成分固定的前提下，采用L934正交实验设计，以饮料的口感为重要指标，优选饮料的基础液用量、糖度和酸度。因素水平见表1。

表1款冬花多糖功能饮料正交实验因素和水平

Tab.1 Factors and levels of the orthogonal experiment for the coltsfoot polysaccharide functional beverages preparation

水平因素A,款冬花多糖/gB,砂糖/gC,柠檬酸/g14050.2025080.24360100.28

2.5.2款冬花多糖功能饮料正交实验根据中国食品药品标准产品口感评价方法的感官评价法，若口感具有柠檬酸味且口感舒适得分50；外观形态清亮透明无肉眼可见杂质得分25；色泽为黄绿色且均匀稳定得分25，根据此评价标准进行评分。结果见表2。

方差分析结果见表3。由表3可知，饮料的最佳配方为A3B2C2，即款冬花多糖60 g，白砂糖8 g和柠檬酸0.24 g。

表2款冬花多糖功能饮料调配正交实验结果

Tab.2 The orthogonal experiment results of coltsfoot polysaccharide functional beverage formulations

实验号A,款冬花多糖B,砂糖C,柠檬酸评分1A1B1C1652A1B2C2723A1B3C3684A2B1C1705A2B2C2786A2B3C3757A3B1C1788A3B2C2859A3B3C380K1205225223K2223222225K3243224223R3832

表3款冬花功能饮料影响因素方差分析结果

Tab.3 Results of variance analysis

方差来源离差平方和SS自由度F值显著性A200245.81360**B12.68222.60744*C0.003228.89818误差0.0013272

注：F0.05(2，2)=19.0，F0.01(2，2)=99.0；**P<0.01，*P<0.05。

2.5.3验证实验为了验证A3B2C2是最佳配方，与感官评价得分80的A3B3C3进行比较，按照1∶5扩大功能饮料实验量的配比，分别平均测试3次，结果见表4。

表4工艺验证结果

Tab.4 Results of process validation

序号款冬花多糖/g白砂糖/g柠檬酸/g感官评分(100)A3B2C2(1)6080.2488A3B2C2(2)6080.2486A3B2C2(3)6080.2486平均6080.2486.66A3B3C3(1)60100.2879A3B3C3(2)60100.2878A3B3C3(3)60100.2879平均60100.2878.66

由表4可知，按照此工艺进行操作，款冬花多糖功能饮料[7-9]的感官评分：A3B2C2平均得分为86.66，而A3B3C3平均得分为78.66 。结果表明，按照A3B2C2制备款冬花多糖功能饮料最为合理。

2.5.4款冬花多糖功能饮料矫味剂的筛选β-环糊精在包合时，结构中全部或部分包入包合分子形成的包合物具有促进药物稳定化、增加难溶性物质和生物利用度、减少不良反应和刺激性的特点，因此利用β-环糊精对款冬花多糖饮料的杂质进行包合，能够掩盖其不良味道，易于让人接受。β-环糊精对杂质包合的处理结果依次为：味道偏涩0.1%，味道偏涩0.20%，味道偏涩0.30%，味道偏涩0.40%。

2.5.5款冬花多糖功能饮料防腐剂的筛选用酸度计测量该饮料的pH值为4.6，考虑到款冬花多糖为液体制剂，为有效防腐，加入的防腐剂[10]为苯甲酸，苯甲酸未解离的分子抑菌作用强，故在酸性溶液中抑菌效果较好，pH值为4时最佳，此类防腐剂适用于中药液体制剂，苯甲酸防腐剂用量为0.1%～0.25%，在该实验中用量为1.5 g。

2.6款冬花多糖功能饮料的抗氧化性实验

2.6.1·DPPH试剂原理·DPPH法是一种快速、简便、灵敏、直接、可行的测试抗氧化实验方法。二苯代苦味酰基是一种很稳定的自由基，在乙醇溶液中呈紫色，在517 nm处有最大吸收峰。当有自由基清除剂(AE)存在时，其单电子被结合而使其颜色减退，在最大吸收波长处的吸光度减小，减小的程度与清除能力及其数量呈定量关系。因此，在517 nm波长处检测款冬花多糖功能饮料·DPPH自由基的清除效果[11-12]，计算其抗氧化能力。当有自由基清除剂存在时，由于与单电子配对而使其吸收逐渐消失，褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因此,可用分光光度计进行快速定量分析。本实验以·DPPH清除率为指标，研究款冬花多糖功能饮料[13]清除·DPPH的能力。

2.6.2实验步骤准确称取0.01 g ·DPPH溶解在无水乙醇中，用250 mL棕色量瓶定容，放入冰箱中备用。实验设1个样品组和2个对照组。在2 mL ·DPPH醇溶液中加入2 mL样品溶液，混匀后避光反应30 min，在517 nm波长处测定吸光度。对照组1用2 mL纯净水代替样品溶液；对照组2用2 mL纯净水代替2 mL ·DPPH醇溶液，按照下式计算样品对·DPPH自由基的清除率I，见表5。并计算出清除率为50%时所对应的质量浓度IC50：

I=1-(Ai-Aj)/A0×100%

式中：Ai为对照组1的吸光度，A0为对照组2的吸光度，Aj为样品组的吸光度。

表5款冬花多糖功能饮料对·DPPH自由基的清除

Tab.5 The results of coltsfoot polysaccharide functional beverage clearing the ·DPPH radicals

样品液质量浓度/mg·mL-1AiAjA0I10.3300.0290.34512.7520.3280.0710.34525.5130.3280.0960.34532.7540.3200.1250.34543.4750.3120.1290.34546.9560.3390.1680.34550.7270.3470.1840.34553.3380.3510.1950.34554.7890.3770.2220.34555.07

3结论

款冬花多糖功能饮料制备最佳配比为：款冬花多糖60 g，砂糖8 g，柠檬酸0.24 g，β-环糊精0.2 g和苯甲酸1.5 g。款冬花多糖功能饮料对·DPPH自由基的清除率为50%时所对应的质量浓度IC50为6 mg·mL-1。

4讨论

参考文献：

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doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.04.022

中图分类号：R944

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)04-0399-04

(收稿日期：2015-10-25)

Preparation of coltsfoot polysaccharide functional beverage and determination of anti-oxidation ability

LI Gaiyan1，LIU Xiaodan1，ZHANG Linna2

(1.Shaanxi Shuntian Pharmaceutical Limited Company，Xi′an 710077，China；2.Shaanxi Xinminsheng Pharmaceutical Limited Company，Xi′an 710026，China)

Abstract:Objective To investigate the optimal preparation conditions of the functional beverage of coltsfoot polysaccharide，and to evaluate the antioxidant capacity.Methods An orthogonal design method was adopted for the functional beverage preparation process，and the oxidation resistance effect was studied by ·DPPH reagent.Results The optimal ratio of the preparation was 60 g coltsfoot polysaccharide，sugar 8 g，citric acid 0.24 g and β-cyclodextrin 0.2 g.Conclusion A suitable preparation process for coltsfoot polysaccharide functional beverages was established,and the polysaccharide functional beverages has significant antioxidant activity.Key words： coltsfoot；polysaccharide；functional beverages；·DPPH antioxidant activity