TP—ELISA法检测梅毒特异性抗体灰区内结果分析

李亦君　陈雪　蒋瑞心

【摘要】 目的 分析酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测梅毒螺旋体（TP）特异性抗体时， 检测数据在灰区范围内的结果。方法 15181份血清标本经ELISA 法筛查梅毒特异性抗体， 以临界值（cutoff）±20%为灰区即吸光度/临界值（s/co）在0.8～1.2区间内， 0.8～1.0为低值灰区， 1.0～1.2为高值灰区， 初筛吸光度（OD）值在灰区的标本应用TP明胶颗粒凝集试验（TPPA）法进行确认。结果 15181份标本中有96份标本数值落在灰区内， 96份中低值灰区 59份， 高值灰区 37份 。15181份标本最终确认为阳性 233份， 阳性率为1.53%（233/15181）， 其中灰区内标本确认阳性 25份， 占灰区标本的 26.04%（25/96）， 占总阳性标本的 10.73%（25/233）；71份确认阴性， 占灰区标本的 73.96%（71/96）。灰区内标本进行 TPPA复检 25份阳性中， 低值灰区 8份， 占灰区阳性数的 32.00%（8/25）， 高值灰区 17份， 占灰区阳性数的68.00%（17/25）。低值灰区 TPPA稀释度为 1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280时标本数分别为3、2、1、0、2份， 高值灰区标本数分别为6、4、3、2、2份。结论 ELISA法检测TP抗体， OD值处于灰区的， 不能单纯以高于cutoff值判定阳性， 低于cutoff值作为判定阴性的标准， 应该进行TPPA复检。

【关键词】 梅毒螺旋体；特异性抗体；酶联免疫吸附试验；灰区

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.16.005

【Abstract】 Objective To analysis detection data in gray zone of treponema pallidum （TP） specific antibody by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Methods ELISA was applied to detect TP specific antibody in 15181 serum samples， and cutoff±20% as gray zone. In absorbance/cutoff （s/co） as 0.8～1.2， low value gray zone was 0.8～1.0 and high value gray zone was 1.0～1.2. Treponema pallidum particle assay （TPPA） was applied to confirm samples with gray zone optical delnsityin preliminary screening. Results There were totally 96 samples with value in gray zone among 15181 samples. Among the 96 cases， 59 cases were in low value gray zone and 37 cases in high value gray zone. There were 233 confirmed positive cases among 15181 cases， with positive rate as 1.53% （233/15181）， including 25 confirmed positive cases in gray zone， accounting for 26.04% （25/96） in gray zone and 10.73% （25/233） in all positive cases， and 71 confirmed negative cases， accounting for 73.96% （71/96） in gray zone. Reexamination by TPPA showed 25 positive cases in gray zone， with 8 cases in low value gray zone， accounting for 32.00% （8/25） in gray zone， and 17 cases in high value gray zone， accounting for 68.00% （17/25） in gray zone. Under TPPA dilution as 1∶80， 1∶160， 1∶320， 1∶640， 1∶1280， sample counts were respectively 3， 2， 1， 0， 2 in low value gray zone and 6， 4， 3， 2， 2 in high value gray zone. Conclusion In ELISA detection of TP antibody， positive and negative can not be singly determined by gray zone OD value and cutoff value， thus TPPA is necessary in reexamination.

【Key words】 Treponema pallidum； Specific antibody； Enzyme linked immunosorbent assay； Gray zone

梅毒是一类慢性接触性传染性疾病[1]， 人感染后可以导致全身多组织、器官的损伤和病变， 其病原微生物是TP。近年来， 梅毒在我国的发病呈上升趋势[2， 3]。目前， 用人工培养TP尚未成功[4]， 所以临床主要根据血清学检测、既往病史、各种临床表现进行梅毒的诊断。在检测过程中， 因为ELISA法具有灵敏度高、特异性强、适用于大批量检测的优点， 是目前实验室检测梅毒特异性抗体最常用的方法。但同时因为方法学限制， ELISA检测受很多因素影响， 所以结果的判读需要谨慎， 尤其是灰区内结果判读， 可以借助其确认试验——TPPA进行辅助判定。作者对本院ELISA法检测梅毒特异性抗体的OD值落在灰区内的标本进行了TPPA法复检， 现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 血清标本来自本院2015年1～12月门诊及住院患者中进行TP特异性抗体筛查的标本15181份。以（cutoff值±20%）范围设定为灰区， 其中96份（96例患者）落入该范围， 男57例， 平均年龄48.7岁， 女39例， 平均年龄39.3岁。

1. 2 仪器与试剂 ELISA采用北京万泰公司的TP试剂盒；TPPA采用日本富士瑞必欧株式会社试剂盒。仪器采用伯乐公司EVOLIS全自动酶标仪。

1. 3 检测方法 TP-ELISA采用两步法， 结果判定根据s/co值， 数值<0.8为阴性， 数值>1.2为阳性， 数值在0.8～1.2灰区范围内为不确定。阳性标本需按梅毒的逆向检测流程继续检测[5]。灰区内标本：s/co数值在0.8～1.0为低值灰区；1.0～1.2为高值灰区， 用TPPA复检确认。根据说明书， TPPA以1∶80为判断标准。所有操作严格按照试剂盒说明书要求。

2 结果

2. 1 灰区标本比例 检测15181份标本中有96份标本数值落在灰区内， 占检测总数0.63%。96份中低值灰区59份， 占灰区总数61.46%， 高值灰区37份， 占灰区总数38.54%。见表1。

2. 2 阳性标本 阳性标本比例：15181份标本最终确认为阳性233份， 阳性率为1.53%（233/15181）， 其中灰区内标本确认阳性25份， 占灰区标本的26.04%（25/96）， 占总阳性标本的10.73%（25/233）；71份确认阴性， 占灰区标本的73.96%（71/96）。低、高值灰区内阳性比例：灰区内标本进行TPPA复检25份阳性中， 低值灰区8份， 占灰区阳性数的32.00%（8/25）， 高值灰区17份， 占灰区阳性数的68.00% （17/25）。见表2。

2. 3 TPPA复检情况 低值灰区TPPA稀释度为1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280时标本数分别为3、2、1、0、2份， 高值灰区标本数分别为6、4、3、2、2份。见表3。

3 讨论

ELISA法检测TP特异性抗体多采用两步法， 原理为双抗原夹心。由于该方法具有良好的标准化和自动化， 且成本低， 所以为目前基层医院检测梅毒抗体的首选方法[6]。作者检测应用的是北京万泰公司的TP试剂盒， 其微孔条包被的是重组TP特异性抗原。但是ELISA法检测过程中容易受外界因素影响， 同时包被的基因只是部分片段， 并不是针对TP全段， 所以会存在一定假阳性、假阴性的情况。为了避免此类情况， 作者采取如下措施：①ELISA法检测中， 标本的s/co值是研究对象。检测梅毒特异性抗体时， 对于s/co高值部分假阳性的排查， 可以应用目前推荐的逆向检测流程， 借助TPPA以及非特异性抗体检测来弥补， 在之前的研究中也有过分析[5]。②对于假阴性情况。ELISA法若单纯以cutoff为分界线判定阴阳性过于片面， 所以本实验根据梅毒抗体检测的“灰区”情况进行了相应研究。“灰区”指处于cutoff值周围一定范围， 通常将其上下20%检测值视为“灰区”[7]。在本次实验中根据cutoff值又把灰区细分为高、低两区。对经ELISA检测在灰区内的标本进行TPPA确认实验， 结果发现在低值灰区和高值灰区内的标本都出现了TPPA复检阳性的情况。

结合国内外多项研究， ELISA商品化试剂只包被几个重组蛋白抗原[8-10]， 虽然敏感性和特异性日趋完善， 但是与TPPA 试剂是以TPNichols株全病原体作为抗原[11]仍有一定差距， 这时应用ELISA法检测时， 单纯以cutoff值做分水岭来判定阴阳性就有可能出现漏检， 尤其是对于早期梅毒的患者。

另外研究中还发现， 即使在低值灰区中检出的TPPA阳性者也有达到1∶1280的高稀释比例。所以在灰区内ELISA 检测数值与TPPA法检测稀释度并不一定完全符合正相关的关系， 这也与包被物质不同有关。

本次灰区内检出的阳性标本占到了总阳性标本数的10.73%， 说明通过设立“灰区”， 并进行TPPA确认试验， 在一定程度上避免了漏检。

梅毒容易带来一定的社会问题， 在检测中应该根据实际工作情况和临床需要尽可能选择多方法联合检测， 最大限度减少漏检和误诊。本次研究针对漏检的情况， 从灰区下手进行确认试验， 但是在低于灰区的部分是否还存在一定比例的假阴性情况， 由于TPPA 操作方法不适于大批量标本， 所以没有进一步研究。今后将扩大研究范畴， 为梅毒检测探索出更为准确、合理的流程尽最大努力。

参考文献

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[11] 邓美霞.梅毒实验室检测方法的研究进展.微生物学免疫学进展， 2016， 44（1）：76-82.

[收稿日期：2016-02-26]