外周血白细胞端粒长度与早发冠心病的相关性及其影响因素分析

田然，张磊楠，张婷婷，黎婧怡，陈连凤，刘震宇，沈珠军，曾勇，谢洪智，张抒扬



外周血白细胞端粒长度与早发冠心病的相关性及其影响因素分析

田然，张磊楠，张婷婷，黎婧怡，陈连凤，刘震宇，沈珠军，曾勇，谢洪智，张抒扬

摘要

目的：探究外周血白细胞端粒长度（LTL）与早发冠心病的相关性及其影响因素。

方法：纳入早发冠心病患者128例（早发冠心病组，其中急性冠状动脉综合征患者88例，稳定性冠心病患者40例），非冠心病患者128例（非冠心病组），两组≤30岁、31～40岁、41～50岁、51～60岁年龄段患者均为2、14、65、47例。采用荧光定量方法测定外周血LTL，采用Spearman相关及多元线性回归，分析LTL与早发冠心病的相关性及其影响因素。

结果：早发冠心病组中急性冠状动脉综合征患者的男性比例、Gensini评分较稳定性冠心病患者高，端粒与单拷贝基因比率（T/S比率）、LTL较稳定性冠心病患者低，差异有统计学意义（P均＜0.05）。早发冠心病组外周血T/S比率较非冠心病组显著降低（0.88±0.86 vs 1.10±0.57，P＜0.05），但两组10年T/S比率变化值差异无统计学意义（-0.17±0.10 vs -0.25±0.07，P=0.63）。早发冠心病组和非冠心病组T/S比率与年龄均呈负相关（ r=-0.275，P=0.002；r=-0.316，P=0.000）。Spearman相关分析显示，早发冠心病组患者LTL与高脂血症（r=-0.415，P=0.049）、糖尿病（r=-0.472，P=0.036）均呈明显负相关。多元线性回归分析显示，早发冠心病组LTL与年龄呈负相关（B=-0.023，P=0.038）；非冠心病组LTL与年龄（B=-0.027，P=0.000）、吸烟史（B=-0.278，P=0.012）、高密度脂蛋白胆固醇（B=-0.297，P=0.046）水平均呈负相关。

结论：在早发冠心病患者中，急性冠状动脉综合征患者男性更多见、LTL更短、冠状动脉病变更加严重。与非冠心病组比较，早发冠心病患者的外周血LTL明显缩短但缩短速率并未增加。早发冠心病患者LTL与高脂血症、糖尿病明显负相关，年龄的增长是导致其端粒缩短的最主要因素；而对于非冠心病患者，除了年龄增长外，吸烟、高密度脂蛋白胆固醇水平改变也是引起端粒缩短加速的主要因素。

关键词 冠状动脉疾病；白细胞；端粒；危险因素

Objective： To explore the changes of peripheral leukocyte's telomere length （LTL） in patients of premature coronary artery disease （PCAD） with influencing factors.

Methods： Our research was conducted in 2 sets of groups， by coronary artery condition： PCAD group， n=128 including 88 patients with ACS， 40 with SCAD and Non-CAD group， n=128 subjects； by age status： the age≤30 years， 31-40 years， 41-50 years， 51-60 years had 2， 14， 65， 47 patients in each group respectively. Peripheral LTL was detected by fluorescent quantitative analysis， the relationship between LTL and PCAD with influencing factors were studied by Spearman correlation analysis.

Results： In PCAD group， compared with SCAD patients， ACS patients had more male gender， higher Gensini score，lower T/S ratio and shorter LTL， all P＜0.05. Compared with Non-CAD group， PCAD group had decreased T/S ratio （0.88 ± 0.86）vs （1.10 ± 0.57）， P＜0.05. T/S ratio was negatively related to age in both PCAD group （r=-0.275， P=0.002） and Non-CAD group （r=-0.316， P=0.000）. Spearman correlation study presented that in PCAD group， LTL was negatively related to hyperlipidemia （r=-0.415， P=0.049） and diabetes （r=-0.472， P=0.036）； multi linear regression analysis indicated that in PCAD group， LTL was negatively related to age （B=-0.023， P=0.038） and in Non-CAD group， LTL was negatively related to age （B=-0.027， P=0.000），smoking （B=-0.278， P=0.012）， HDL-C （B=-0.297， P=0.046）.

Conclusion： PCAD had more male ACS patients with shorter LTL and severer coronary lesions； LTL was negatively related to hyperlipidemia and diabetes， age was an important influencing factor for LTL shortening.

Key words Coronary artery disease； Leukocytes； Telomere； Risk factors

（Chinese Circulation Journal， 2016，31：541.）

冠心病是严重危害人类健康的心血管疾病，近年来，发病率升高，并趋于年轻化。 Framingham研究关于早发冠心病的定义为：冠心病的发病年龄＜55岁（男）或＜65岁（女）。早发冠心病患者发病年龄早，临床表现及冠状动脉病变特点突出，具有更加显著的遗传背景，受到了越来越多的关注［1， 2］。端粒是位于真核生物染色体末端的帽样结构，能够维持染色体稳定性。既往研究表明，冠心病患者的端粒缩短可作为心血管风险增加的一种标志物［3］，端粒缩短可能促进细胞衰老、凋亡，参与动脉粥样硬化和冠心病的发生。早发冠心病患者冠状动脉传统危险因素少，其端粒长度可能更能反映其遗传特性。本研究旨在探讨外周血白细胞端粒长度（LTL）与早发冠心病的相关性及其影响因素。

1 资料与方法

1.1 研究对象

按照年龄、性别匹配原则，共纳入2012-07至2014-01期间在我院心内科住院的患者256例。早发冠心病患者128例（早发冠心病组，其中急性冠状动脉综合征患者88例，稳定性冠心病患者40例），男性年龄＜55岁，女性年龄＜65岁，并经皮冠状动脉造影证实冠状动脉狭窄程度≥50%。非冠心病患者128例（非冠心病组）为经冠状动脉造影除外冠心病者。两组≤30岁、31～40岁、41～50岁、51～60岁年龄段患者均为2、14、65、47例。排除标准：心肌炎、心包炎；引起胸痛的其他原因（如：肺栓塞、主动脉瘤、先天性心脏病、肥厚性心肌病等）；非冠状动脉粥样硬化病变所致心肌酶升高（如：冠状动脉畸形、川崎病、多发性大动脉炎及手术治疗等）；明确的感染性疾病、发热（体温＞37.5℃）；结缔组织病；肿瘤；肝、肾功能衰竭患者。

1.2 临床资料的收集

查阅所有入选病例的基线资料：年龄、性别、高血压、糖尿病、血脂异常、冠心病家族史、吸烟饮酒情况，根据身高和体重计算体重指数。记录检验检查指标：总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、血肌酐、血尿素氮、空腹血糖、糖化血红蛋白。详细记录冠状动脉造影情况：包括病变血管支数、分布及其病变程度，犯罪血管情况，并对每个患者的血管病变程度进行Gensini 评分。

1.3 方法及试剂

全部患者抽取静脉血4 ml，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管，离心后分离血细胞和血浆。部分血细胞用于脱氧核糖核酸（DNA）提取，并于-80℃保存。DNA提取采用天根生化科技公司（北京）Blood DNA Extraction Kit试剂盒进行。LTL测定采用宝生物公司（大连）Takara SYBR Green Ⅱ荧光定量试剂盒测定。实验方法参考文献［4］，LTL（kb）=1.585×端粒与单拷贝基因比率（T/S比率）+3.582。根据参考文献［4］，设计引物，并由英潍捷基贸易有限公司（上海）合成。T反应引物：正向引物：5'- GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT GAGGGT-3'，反向引物： 5'-TCCCGACTATCCCTATC CCTATCCCTATCCCTATCCCTA-3'；S反应引物：正向引物：5'- CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3'，反向引物：5'-CCCATTCTATCATCA ACGGGTACAA-3'。

1.4 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，符合正态分布者采用t检验，计数资料用百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。LTL与单项临床指标的关系采用双变量相关分析检验相关程度，用Spearman相关系数反映相关方向，对年龄、性别因素的调整采用偏相关分析。LTL与多项临床指标的关系采用多元线性回归分析，非正态分布的资料取自然对数转化为正态资料后进行分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者临床资料和生化指标比较（表1）

早发冠心病组糖尿病、冠心病家族史、吸烟的比例，以及体重指数、谷丙转氨酶、血尿素氮、空腹血糖、糖化血红蛋白、甘油三酯、高敏C反应蛋白水平明显高于非冠心病组（P均＜0.05），而高密度脂蛋白胆固醇水平、总胆固醇、T/S比率、LTL明显低于非冠心病组（P均＜0.05）。早发冠心病组中急性冠状动脉综合征患者的男性比例、Gensini评分均较稳定性冠心病患者高，T/S比率、LTL较稳定性冠心病患者低，差异有统计学意义（P均＜0.05）。

表1 两组患者临床资料和生化指标对比（±s）

表1 两组患者临床资料和生化指标对比（±s）

注：LTL：白细胞端粒长度；T/S比率：端粒与单拷贝基因比率。与非冠心病组比*P＜0.05；与组内稳定性冠心病患者比△P＜0.05。-：无

项目 非冠心病组（n=128）早发冠心病组全部患者（n=128）急性冠状动脉综合征患者 （n=88）年龄 （岁） 48.5±7.3 48.6±7.3 50.0±7.6 47.9±7.1男性 ［例 （%）］ 74 （57.8） 74 （57.8） 12 （30.0） 62 （70.5）△高血压［例 （%）］ 45 （35.2） 82 （64.1） 24 （60.0） 58 （65.9）糖尿病［例 （%）］ 30 （23.4） 43 （33.6）*12 （30.0） 31 （35.2）冠心病家族史［例 （%）］ 29 （22.7） 48 （37.5）*9 （22.5） 39 （44.3）吸烟［例 （%）］ 37 （28.9） 64 （50.0）*14 （35.0） 50 （56.8）体重指数 （kg/m2） 24.0±3.0 26.2±3.2*26.4±3.2 26.1±3.3谷丙转氨酶 （U/L） 19.7±9.4 40.7±61.5*28.3±23.5 46.2±71.7血肌酐 （μmol/L） 73.5±11.9 72.2±21.6 65.7±16.6 72.0±22.2血尿素氮 （mmol/L） 4.77±0.98 5.61±2.18*5.61±2.11 5.79±2.22空腹血糖 （mg/dl） 5.15±0.45 6.47±2.26*6.10±2.89 6.26±1.87血红蛋白 （g/L） 146.38±12.83 139.22±19.28 132.60±13.42 140.55±20.05糖化血红蛋白 （%） 5.43±0.29 6.86±1.94*6.09±2.55 6.72±2.08总胆固醇 （mmol/L） 4.57±0.56 4.38±1.05*4.63±0.87 4.72±1.09甘油三酯 （mmol/L） 1.10±0.31 1.98±1.29*1.73±1.11 2.03±1.32高密度脂蛋白胆固醇 （mmol/L） 1.40±0.33 1.00±0.21*1.01±0.21 1.00±0.21低密度脂蛋白胆固醇 （mmol/L） 2.87±0.49 2.73±0.77 2.65±0.69 2.75±0.78高敏C反应蛋白 （ng/ml） 0.86±0.66 9.30±22.5*4.38±8.93 10.2±24.2 Gensini评分 （分） - 38.3±29.7 27.6±20.5 43.2±31.9△T/S比率 1.10±0.57 0.88±0.86*0.90±1.18 0.87±0.69△LTL （kb） 5.32±0.91 4.97±1.37*5.00±1.86 4.97±1.09△稳定性冠心病患者（n=40）

2.2 外周血LTL与年龄的相关性（表2、图1）

早发冠心病组和非冠心病组10年T/S比率变化值差异无统计学意义（-0.17±0.10 vs -0.25±0.07，P=0.63）。除31～40岁年龄段外（P=0.098），早发冠心病组其余年龄段的T/S比率均明显小于非冠心病组（P均＜0.05）。非冠心病组的T/S比率随年龄下降呈明显下降趋势，而早发冠心病组≤30岁患者的T/S比率介于41～50岁和51～60岁患者之间，同时小于非冠心病组51～60岁患者（P＜0.05）。早发冠心病组及和非冠心病组T/S比率与年龄均呈负相关（r=-0.275，P=0.002；r=-0.316，P=0.000）。

2.3 LTL与临床指标及冠心病危险因素的Spearman相关性分析（表3）

调整年龄和性别因素后，早发冠心病组LTL与高脂血症、糖尿病均呈明显负相关（P＜0.05）。而非冠心病组LTL与高血压、吸烟均呈明显负相关（P＜0.05）。

2.4 LTL与临床指标及冠心病危险因素的多元线性回归分析（表4）

以T/S比率为因变量多元线性回归分析，早发冠心病组LTL与年龄呈负相关（P=0.038），与糖尿病呈负相关性不显著（P=0.090）。非冠心病组LTL与年龄（P=0.000）、吸烟史（P=0.012）、高密度脂蛋白胆固醇（P=0.046）水平呈负相关。

表2 两组不同年龄段患者T/S比率比较（±s）

表2 两组不同年龄段患者T/S比率比较（±s）

注：T/S比率：端粒与单拷贝基因比率。与非冠心病组同年龄段比*P＜0.05；与非冠心病组51～60岁比△P＜0.05

年龄 非冠心病组（n=128） 早发冠心病组（n=128）例数 T/S比率 例数 T/S比率≤30岁 2 1.68±0.14 2 0.87±0.08*△31～40岁 14 1.42±0.77 14 1.11±0.96 41～50岁 65 1.14±0.55 65 0.97±0.81*51～60岁 47 0.90±0.48 47 0.69±0.91*

图1 早发冠心病组和非冠心病组T/S比率与年龄的关系

表3 调整年龄和性别因素后LTL与临床指标及危险因素的Spearman相关性分析

表4 两组患者LTL与相关指标及危险因素的多元线性回归分析

3 讨论

近年来，国内外的多项研究表明，外周血LTL缩短与动脉粥样硬化和冠心病的发病风险相关。端粒作为染色体末端的一种保护结构，与细胞凋亡和衰老相关疾病的发生有密切关系。本研究提示早发冠心病和非冠心病两组患者特征明显不同，早发冠心病组糖尿病、冠心病家族史、吸烟比例明显高于非冠心病组，且与非冠心病组相比，早发冠心病组体重指数、谷丙转氨酶、血尿素氮、空腹血糖、糖化血红蛋白、甘油三酯、高敏C反应蛋白水平明显升高，而高密度脂蛋白胆固醇水平明显降低。两组间总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇没有明显差异，这可能与一部分早发冠心病组患者就诊前已经接受了相应降脂药物治疗有关。

本研究结果显示早发冠心病组LTL比非冠心病组明显缩短，这与既往文献报道结果基本一致［5， 6］。LTL主要取决于两方面，一是遗传因素，不同种族、不同个体，以及同一个体的不同组织中LTL都可能存在差别［7， 8］。二是端粒缩短的程度。正常情况下体细胞每传代1次，端粒缩短30～150 bp［9］。当端粒缩短达到一定阈值时，细胞就会发生衰老和死亡。对早发冠心病和非冠心病组LTL和年龄相关性的分析显示，两组患者LTL均随年龄增长而缩短，这与既往结果一致［6］。本研究显示两组患者的LTL与年龄均呈负相关，这可能提示早发冠心病组LTL缩短主要与遗传因素相关。另外由于部分早发冠心病患者合并高血压、高脂血症、糖尿病等基础疾病，相关的药物治疗可能抑制端粒缩短的加速，因此端粒缩短速度与非冠心病组未产生明显差异。目前已有实验证明，在人外周血单个核细胞中，他汀可以通过调节端粒酶活性，从而调节端粒长度［10］。

早发冠心病组≤30岁患者LTL的平均值明显低于本组31～40岁和41～50岁两个年龄段LTL的平均值，这可能是由于样本量小造成的。同时由于这两年龄段患者LTL值的影响，使得早发冠心病组LTL随年龄变化的整体趋势趋于平缓。本研究发现调整年龄和性别因素对LTL的影响后，早发冠心病患者LTL的缩短受到高脂血症和糖尿病的影响，非冠心病组LTL的缩短主要与高血压、吸烟相关。多元线性回归分析则提示早发冠心病患者LTL与年龄呈显著负相关，与糖尿病具有关联但并不显著。非冠心病患者LTL则与年龄、吸烟史、高密度脂蛋白胆固醇水平呈显著负相关，这与不少前期研究中的结论一致。多项研究发现，2型糖尿病患者的LTL和健康对照相比缩短，且合并2型糖尿病的冠心病患者更短［11， 12］。一项针对中国人群的研究发现，在379例正常对照患者中，端粒更长者比端粒较短者高密度脂蛋白胆固醇水平更低［13］。另一研究发现，高血压患者较血压正常者端粒更短，同时发生冠心病风险升高。Flemish研究观察到吸烟者比不吸烟者端粒更短。与不吸烟人群相比，吸烟1年每天吸1包烟人群相当于端粒DNA额外减少5对碱基［14］。最近发表的一项大规模横断面研究结果也说明吸烟与端粒缩短相关［15］。

本研究结果提示，早发冠心病患者的外周血LTL缩短可能作为患病及疾病严重程度的预测指标，可以通过进一步扩大样本量的研究来明确对于端粒长度和早发冠心病的相关性。同时端粒缩短是否诱发细胞凋亡而影响血管内皮细胞、平滑肌细胞等的功能，从而参与早发动脉粥样硬化的进程值得进一步探索。由于端粒DNA、端粒相关蛋白、端粒酶作为一个整体对于染色体末端起到重要保护作用，端粒相关蛋白的表达水平改变、端粒酶表达水平及活性改变相关的研究可能会揭示早发冠心病的部分发病机制。

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（编辑：王宝茹）

Corresponding Author：ZHANG Shu-yang， Email： shuyangzhang103@163.com

收稿日期：（ 2015-11-23）

基金项目：教育部博导类基金（20131106110007）

作者单位：100730 北京市，中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 心内科 协和转化医学中心（田然、张磊楠、黎婧怡、陈连凤、刘震宇、沈珠军、曾勇、谢洪智、张抒扬、）；阜外医院（张婷婷）

作者简介：田然 主治医师 博士 主要从事冠心病发病机制的相关研究 Email：ron_tian@163.com 通讯作者：张抒扬 Email：shuyangzhang103@163.com

中图分类号：R54

文献标识码：A

文章编号：1000-3614（2016）06-0541-05

doi：10.3969/j.issn.1000-3614.2016.06.005

Changes of Peripheral Leukocyte's Telomere Length in Patients of Premature Coronary Artery Disease With Influencing Factors

TIAN Ran， ZHANG Lei-nan， ZHANG Ting-ting， LI Jing-yi， CHEN Lian-feng， LIU Zhen-yu， SHEN Zhu-jun， ZENG Yong，XIE Hong-zhi， ZHANG Shu-yang.
Department of Cardiology， Peking Union Medical College Hospital， CAMS and PUMC， Beijing （100730）， China

Abstract