质量控制图在蓝舌病竞争ELISA检测中的应用

郭铮蕾，谷 强，韩 玥，徐 姗，李 伟（北京出入境检验检疫局，北京 10026）



质量控制图在蓝舌病竞争ELISA检测中的应用

郭铮蕾，谷 强，韩 玥，徐 姗，李 伟
（北京出入境检验检疫局，北京 10026）

摘 要：［目的］建立蓝舌病竞争ELISA检测的质量控制图。［方法］采用即刻法与Levey-Jennings 常规质控图法结合，绘制连续20次检测结果的质控图。更换质控血清批号和试剂盒批号时，采用双质控法对前3次实验结果做质控，再转入常规质控图。 ［结果］用即刻法对质控物进行3次连续测定后，就可对第3次检测结果进行质量控制，用此方法积累20次质控物的检测结果后，可用Excel绘制出Levey-Jennings 常规质控图，用以实验室日常质控。若实验室更换质控血清批号和试剂盒批号，采用双质控法对前3次实验结果做质控。［结论］采用双质控法对前3次实验结果做质控，改进了即刻法只能从第3次结果进行质控的缺点，加强了即刻法在ELISA检测中的质控作用。

关键词：质量控制图；即刻法；双质控；ELISA；蓝舌病

控制图是对检测过程中质量的特征值进行测定、记录、评估，从而观察检测过程是否处于控制状态的、采用统计方法设计的图。实验室使用控制图是为了预防不符合工作的发生，这是实验室内部质量控制的重要方法。CNAS- CL52：2014 《CNAS-CL01＜检测和校准实验室能力认可准则＞应用要求》［1］5.9.2规定，“适用时，实验室应使用质量控制图来监控检测或校准结果的准确性和精密度”。质量控制图多用于实验室定量分析的质量控制，在免疫学方面多应用于医学实验室，但应用于动检领域的ELISA方法未见报道。

与一般定量分析的质控方法相比，ELISA检测的室内质控有其特殊性。ELLSA检测试剂盒的有效期短，批号更换较频繁，因此实验室在短期内很难积累20次质控物的检测结果，所以对同一批号试剂在常规条件下连续检测20次，难度大，易造成数据不足，难以做出完整的质控图，进而不能即时进行试验监控，失去了质控意义。

目前，对ELISA试验的实验室内质控，常规上采用即刻法（Grubbs 法）和Levey-Jennings 常规质控图（简称L-J图）结合的方法［2-3］。用即刻法连续测量3次就可对第3次结果进行质控，弥补了L-J图需要连续测定20次才能进行质控的局限，但是使用即刻法无法判断前2次的检测结果是否在控，而采用双质控法［4-5］对前3次试验结果进行质控，再按即刻法处理，即可达到控制的目的。

1 材料与方法

1.1 仪器与 试剂

酶标仪（Multiskan FC）、洗板机（Wellwash Versa ）、蓝舌病竞争试剂盒（IDVET，批号656、680）。

1.2 即刻法绘制质控图

按ELISA试剂盒说明书操作，以450 nm波长比色，按说明书计算临界值（cut-off值，CO），每个板测两个阴性对照，CO=OD阴*0.4，每个板测两个阳性对照，S=OD阳，用S/CO值表示质控值，从第3次测量开始用“即刻法”对结果进行质控，计算3次S/CO值的均值（）和标准差（s），再计算SI上限和SI下限，查SI值表判断质控结果有无失控［6］，按照Grubbs剔除异常值的方法［6］，若结果处于“告警”或“失控”状态应舍去，并重新测定质控血清；若结果处于控制范围内，继续检测并计算，积累20次测定结果后，用Excel画出L-J质控图。具体做法是：

在Excel中输入20次测量的OD阳、OD阴，用AVERAGE函数公式计算D阳、D阴，编辑函数公式，计算CO值和S/CO值。从第3次的测量结果开始，用AVERAGE函数计算S/CO的平均值（），用SDTV函数计算标准差（s）。从第3次的测量结果开始，用MAX函数和MIN函数分别计算最大值和最小值。编辑函数（xmax-）/s计算SI上限，编辑函数（-xmin）/s计算SI下限。根据SI值表，用IF函数编辑上限结果和下限结果的在控状态，当SI上限和SI下限均小于n2s时，表示结果“在控”；当SI上限或SI下限处于n2s和n3s之间时，表示结果“告警”；当SI上限或SI下限大于n3s时，表示结果“失控”。处于“告警”和“失控”状态的数值应舍去。

以测量次数作为横坐标、以S/CO值作为纵坐标，用Excel绘制L-J常规质控图，系列分别选择“质控数据（S/CO）” “上控制限UCL（+3s）” “UWL上警戒限（+2s）” “中心线CL（）” “下警戒限LWL （-2s）” “LCL下控制限（-3s）”。设置纵坐标的最大值为+4s、最小值为—x-4s、主要刻度单位为s值、次要刻度单位为s/10的值。

表1 SI值表

1.3 双质控法绘制质控图

在更换质控血清批号时，将新批号的质控血清在旧批号质控血清即将结束使用时与旧批号质控血清一起测定3次，也就是在同一酶标板上分别加新、旧批号的质控血清。旧批号质控血清数据点进上一质控图计算，新批号血清的质控结果按即刻法分析。在更换试剂盒批号时，在旧批号的试剂盒即将结束使用时将新批号试剂盒的部分孔位与旧批号试剂盒同时测定3 次，两种试剂盒均加入同一批号的质控血清，旧批号试剂盒的质控结果点进质控图，新批号血清的质控结果按即刻法分析。

2 结果

2.1 即刻法绘制质控图

从表2中看出，第4次和第5次数据出现了“失控”的情况。按照Grubbs法剔除异常值，将第4次的测量结果剔除掉后，以下的测量结果均在控。剔除异常值后的测量结果见表3，画L-J质控图，如图1所示。

表2 即刻法所得20次测量结果及数值在控状态

根据控制图的判断原则［7］，未出现判稳准则和判异准则中的以下异常情况：21个点中有1点落在3s以外；连续9点落在中心线同一侧；连续6点递增或递减；连续14点中的相邻点交替上下；连续3点中的2点落在中心线同一侧2s以外；连续5点中的4点落在中心线同一侧1s以外；连续15点落在中心线两侧的1s以内；连续8点落在中心线两侧，且无一在1s以内。因此，本批次20次质控值建立起的质控图是有效的。

2.2 双质控法绘制质控图

2.2.1 两种批号质控血清双质控法的结果见表3，旧批号40～42 次的质控血清与新批号1～3 次的质控血清对应同板试验。

2.2.2 两种批号试剂盒双质控法结果见表4，旧批号试剂盒31～33次与新批号试剂盒1～3 次对应同批质控血清试验。

表3 Grubbs法剔除异常值后的20次测量结果

3 讨论

在检测工作中进行实验室内部质量控制是降低实验误差、保证检测质量的重要手段。对于定量检测项目，大多采用Levey-Jenings质控方法或Westgard多规则质控方法绘制质控图。免疫学很多检测项目采用ELISA法定性，但因手工法和半自动化等特点导致其难以标准化，且检测频次低、试剂盒有效期短、批号更换频繁，因此ELISA试验的质控图多采用即刻法与常规质控图结合的方法。

图1 蓝舌病竞争ELISA质控图

图2 蓝舌病竞争ELISA旧批次质控血清24～42次质控数据质控图

表4 不同批次质控血清质控数据

表5 不同批次试剂盒质控数据

图3 蓝舌病竞争ELISA旧批次试剂盒15～33次质控数据质控图

不同于定量检测项目选取被测性能在重复试验中相对稳定的值作为特征值，免疫学试验中临界于cut-off值（CO值）的低值弱阳性质控物是质控的关键，低值弱阳性-临界值血清是质控精密度观测的最敏感的窗口，也是提示试验是否成功的标识，因此选择S/CO值作为质控的特征值。

Grubbs法是一种离群值检验的统计方法，一组测定值中的明显偏离测定值群体的过大或过小值称为离群值，其既可能是测定结果随机波动的极值，也可能是与群体测定值非属同质总体的异常值。如果事先给定一个小概率事件临界点作为随机因素影响的最大波动值（即SI界值表），那么凡是测定偏差超过临界值的离群值将被视为异常值，反之被视为极值加以保留。使用即刻法在出现“告警”或“失控”值时，对于结果的取舍有两种意见，一是出现“告警”或“失控”值时，剔除末次测定值；二是出现“告警”或“失控”值时，剔除最大偏离值。Grubbs法用公式SI上限=（Xmax-）/s，SI下限=（-Xmin）/s计算SI上限和SI下限值，然后与临界值表（即SI值表）进行比较，以判断临界值是否为异常值，因此Grubbs法是判断一组测定值中的极大或极小值是“在控极值”还是“异常值”的方法，不能用末次测定值作为异常值。

在表2中，从第4次测定结果开始，连续出现了2个“失控” 值，由于第4次的测量结果与前3次比是最大值，第4次极值引发了第5次测量值的失控，因此剔除了第4次极大值后，以下结果均变为“在控”。

由于即刻法是从当天和以前的所有测定值中找出最大值和最小值，因此在测定次数较少时，用即刻法有些离群值不一定会显示失控，但随着测定次数的增加，测定值逐渐趋于稳定，这时之前的离群值就会暴露显示为“告警”或“失控”，因此Grubbs法判断异常值有一定的滞后性，也被称为“回顾性失控检出”。即刻法的另一个缺点是结果容易受到前3个测定值的影响，因为在统计学中，样本量少时易出现抽样误差。因此会出现即刻法未检出失控值，但是用L-J质控图分析时发生失控的现象，这是由于前3次质控结果精密度差引起的。因此在质控数据较多的情况下，L-J质控图法优于即刻法，所以在20次测定结果完成后，应及时制作L-J质控图进行分析。

由于即刻法是从第3次测定才开始进行质控，双质控法就解决了前2次结果无法进行质控的问题。从表4、表5和图2、图3中可以看出，原试剂盒和原血清均处于“在控”状态，这也就说明所换试剂盒和质控血清的前3次结果也处于“在控”状态，保证了即刻法的所有结果处于连续可靠状态。在免疫学检测中，不同批号试剂盒，甚至同一批号试剂盒的不同板次所检测的样品或质控血清的OD值都会有一定的差异，不同批次质控血清的试验结果也不一定一样，在更换试剂盒或质控血清时，试验结果常处于不稳定状态，且ELISA 试验的影响因素较多，因此更需要建立有效的质控分析。此前，ELISA试验质控图多用在医学检验上，如HBsAg的初筛、抗HIV的初筛等，在动物检疫领域中尚未见报道。本研究将ELISA试验质控图初试于动检领域的蓝舌病毒检测上，为动检领域其它疫病的ELISA检测提供了质控方法的参考。但是，目前还没有ELISA检测的确切质控方法，因此以蓝舌病为初探的质控图方法有待于在动检领域的进一步验证和扩展。

参考文献：

［1］中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL 52：2014 CNAS-CL01《检测和校准实验室能力认可准则》应用要求［Z］.北京：2014.

［2］郑怀竞.免疫学检验室间质评与室内质控［M］.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1997：38-61.

［3］丁海明，潘婉仪.ELISA定性实验“即刻法”室内质控的评价与应用［J］.现代检验医学杂志，2009，24（3）：28-30.

［4］李天君，赵锋，田庆华等.“双质控法”用于ELISA试验室内质控的探讨［J］.中国输血杂志，2004，17（6）：443-444.

［5］段惠玲，李忠俊，滕本秀.应用“双质控法”加强“即刻法”室内质控［J］.重庆医学，2006，35（11）：971-974.

［6］中国国家标准化管理委员会. 数据的统计处理和解释正态样本离群值的判断和处理：GB/T 4843-2008［S］.北京：中国标准出版社，2008.

［7］国家质量技术监督局.常规控制图：GB/T4091-2001［S］.北京：中国标准出版社，2001.

（责任编辑：朱迪国）

Application of Quality Control Chart for Detection of Bluetongue Disease Virus by Competitive ELISA

Guo Zhenglei，Gu Qiang，Han Yue，Xu Shan，Li Wei
（Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026 ）

Abstract ：［Objective］ To establish the quality control chart for detecting bluetongue virus by competitive ELISA.［Methods］The instant method with Levey-Jennings routine quality control chart method was applied to draw an instant-added L-J quality control chart after 20 results were accumulated.While making changes of agent batch number or quality control serum，the double quality control method was used to control the fi rst three detection results and then the routine quality control chart method was used to control the subsequent results.［Results］The three primary quality control data were calculated statistically by instant method.The instant-added L-J quality control chart could be drawn by Excel software after 20 datas were accumulated.While making changes of agent batch number or quality control serum，the double quality control method was used to control the fi rst three results.［Conclusion］The double quality control method solved the problem of uncontrolled test results in the initial times with the instant method and strengthened the quality control with the instant method in ELISA test.

Key words：quality control chart；instant method；double quality control；ELISA；bluetongue

中图分类号：S851.3

文献标识码：B

文章编号：1005-944X（2016）02-0077-05

基金项目：质检总局科技计划项目（2015IK009）——质量控制图在动检血清学检测应用的示范性研究