26种植物甲醇提取物对3种植物病原细菌的抑制活性

2016-07-25魏敬怀周燚余思策向兰香杜晓英

江苏农业科学 2016年6期

魏敬怀++周燚+余思策+向兰香+杜晓英

摘要：以魔芋软腐病菌（Ervinia carotovora pv.carotovora）、白菜黑腐病菌[Xanthomonas campestris pv.campestris （Pam） Dowson]、甜瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae citrulli）为供试菌，采用琼脂药剂扩散法对26种植物进行抑菌活性筛选。结果表明，铜钱细辛、裸芸香和小勾儿茶的甲醇提取物在20 mg/mL时对3种病原细菌均有抑制活性。其中，裸芸香的抑制活性最好，抑菌圈平均直径分别达1.712、1.611、1.889 cm；铜钱细辛的抑菌圈平均直径分别为0962、0.874、1.011 cm；小勾儿茶的抑菌圈平均直径分别为0.671、0.753、0.724 cm。裸芸香石油醚层萃取部在 5 mg/mL 时对魔芋软腐病菌的抑菌活性最好，抑菌圈的平均直径达1.487 cm，是下一步研究的重点。

关键词：植物源农药；甲醇提取物；植物病原细菌；抑菌活性

中图分类号： S482.2+92文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）06-0233-03

收稿日期：2016-03-23

基金项目：湖北省自然科学基金（编号：2015CFA107）。

作者简介：魏敬怀（1990—），男，安徽淮南人，硕士研究生，从事新农药开发的研究。E-mail：weijinghuaizmm@163.com。

通信作者：杜晓英，博士，副教授，硕士生导师，从事农药学的教学与研究工作。E-mail：cjdxdxy@163.com。作物细菌性病害是世界性常发流行性病害，细菌性病害的危害程度比真菌性病害更加严重和更加难以防治[1]。随着蔬菜栽培连作年限的增加，病害发生逐渐加重[2]。魔芋软腐病主要是由胡萝卜软腐欧文氏杆菌（Erwinia bacterium）和菊欧文氏杆菌（Erwinia chrysanthemi）引起的细菌性病害[3]，在魔芋生长和贮藏期均可危害。生长期发病严重时可造成魔芋成片倒苗，发病严重地块一般连作3年后魔芋基本无收成[4]。白菜黑腐病由野油菜黄单胞杆菌（Xanthomonas campestris）引起，是一种世界性十字花科蔬菜重要病害[5]，严重影响白菜的产量和冬贮供应[6]。甜瓜细菌性果斑病又称细菌性果腐病，其病原菌为嗜酸菌属西瓜种（Acidovorax citrulli）[7]，是近年由国外传入我国的一种毁灭性病害[8]。目前针对以上3种病害主要依靠抗病育种和化学药剂防治。抗病育种操作困难且周期较长，化学药剂防治不但污染环境，而且长期大量使用化学药剂易使细菌产生抗性，从而大大降低防治效果。自然界中，植物与病原物长期斗争，此消彼长，结果形成了某些植物独特的抑菌能力。因此研究植物天然物质，寻找结构新颖，作用机理特殊的抑菌活性化合物，是杀菌剂研究与开发的一条重要途径。目前关于植物抑菌成分的研究很多，科研人员发现菊科、唇形科、木兰科、马兜铃科、蓼科、木樨科、百合科、葫芦科、莎草科、豆科、十字花科、樟科等的某些植物中均含有天然杀菌成分[9-10]。本研究采集了26种植物，分别测定其对3种病原菌的抗菌活性，以期筛选到抑菌活性较好的植物，为下一步分离和纯化活性化合物提供材料，同时为进一步开发利用和保护植物资源提供依据。

1材料与方法

1.1供试植物材料

植物材料见表1，由武汉植物园江明喜研究员鉴定。

1.2供试细菌

魔芋软腐病病原菌（Ervinia carotovora pv.carotovora）、白菜黑腐病病原菌[Xanthomonas campestris pv.campestris （Pam） Dowson]、甜瓜细菌性果斑病病原菌（Acidovorax avenae citrulli），以上3种病原细菌由长江大学农学院植病课题组提供，周燚教授鉴定。

1.3培养基及其成分

培养基参照并改进袁尚勇的方法[11]制得。每1 L培养基含牛肉浸膏3 g、蛋白胨10 g、蔗糖10 g、琼脂12 g，培养基pH值调至7.0。

1.4试验方法

1.4.1植物甲醇提取物对3种植物病原菌的抑菌活性测定方法植物有效成分的提取参照陈兴龙等的方法[12]并加以改进，将采集的植物材料阴干，再置于50 ℃电热鼓风箱烘干，粉碎，用5倍植物材料体积的甲醇分别避光浸提3、2、1 d，合并浸提液，过滤浓缩得植物粗提物，密封置于4 ℃冰箱备用。抑菌活性测定采用琼脂药剂扩散法[13]。具体操作如下：称取1 g植物甲醇提取物，用5 mL丙酮溶解，配成浓度为200 mg/mL的提取物母液。取0.5 mL母液用无菌水定容至5 mL，配制成浓度为20 mg/mL的药液备用。病原菌于斜面培养基上 30 ℃ 培养2 d，加入无菌水，刮下菌苔，与无菌水充分混合，用比较仪对照制成含细菌浓度为6×109～6×1010 CFU/L的细菌悬浮液。取200 μL细菌悬浮液加入到定量30 mL熔融冷却至50 ℃左右的培养基中，充分摇匀并用9 cm培养皿倒平板，用直径0.5 cm灭菌打孔器于平板上打孔，并向孔中加入1滴琼脂，每皿3孔，2个孔为药剂处理，均加入50 μL药液，1个孔为空白对照，加入50 μL 10%丙酮溶液。重复3次。将各处理于30 ℃恒温生化培养箱中培养，24 h后观察孔穴周围有无抑菌圈，如有用十字交叉法测量各抑菌圈的直径，去除孔穴直径0.5 cm，取其平均值。

1.4.2裸芸香萃取物对魔芋软腐病原菌的抑制活性测定采取液-液萃取法。分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯与裸芸香提取物的水溶物进行等量液-液萃取，每萃取重复3次，合并浓缩各萃取层得到各层萃取部，密封后置于4 ℃冰箱保存备用。萃取部抗菌活性测定方法同“1.4.1”节，植物萃取物药液浓度为5 mg/mL。

2结果与分析

2.126种植物甲醇提取物对3种病原细菌的抑菌活性初筛

采取琼脂药剂扩散法测定26种植物甲醇提取物对3种病原细菌的抑制活性，结果见表2。由表2可知，在供试的26种植物中，铜钱细辛、小勾儿茶和裸芸香的甲醇提取物在浓度为20 mg/mL时对3种植物病原细菌均有抑制活性。其中裸芸香甲醇提取物对魔芋软腐病菌、白菜黑腐病菌和甜瓜细菌性果斑病菌的抑菌圈直径最大，抑菌圈平均直径分别为1712、1.611、1.889 cm；铜钱细辛甲醇提取物对魔芋软腐病菌、白菜黑腐病菌和甜瓜细菌性果斑病菌的抑菌圈直径次之，抑菌圈平均直径分别为0.962、0.874、1.011 cm；小勾儿茶甲醇提取物对魔芋软腐病菌、白菜黑腐病菌和甜瓜细菌性果斑病菌的抑菌圈直径最小，抑菌圈平均直径仅分别为0.671、0753、0.724 cm。其余供试的23种植物甲醇提取物在浓度为20 mg/mL时对3种植物病原细菌的平均抑菌圈直径均为0，均无抑菌活性。

2.2裸芸香甲醇提取物各萃取部对魔芋软腐病菌的抑菌活性

采取琼脂药剂扩散法测定裸芸香甲醇提取物的各溶剂萃

取部对3种病原细菌的抑制活性，结果见表3。由表3可知，裸芸香甲醇提取物的各有机溶剂萃取部在浓度为5 mg/mL时对魔芋软腐病菌均有抑制作用，其中石油醚萃取部抑菌圈的平均直径最大，达1.487 cm；乙酸乙酯萃取部的抑菌圈平均直径最小，仅为1.159 cm。裸芸香甲醇提取物水部浓缩物浓度为5 mg/mL时对魔芋软腐病菌抑菌圈直径为0，无抑菌效果。

3讨论

本研究测定的26种植物甲醇提取物中，大部分对供试的3种病原细菌无抑制活性，相同的植物提取物对不同的病原细菌的抑制活性也有差别。在对供试3种病原细菌均有抑制活性的3种植物中，在浓度为20 mg/mL时，裸芸香甲醇提取物的抑菌活性最好，铜钱细辛次之，小勾儿茶最差。由于不同病原菌对相同物质的敏感度并不相同，对供试病原菌无活性的这23种植物也可能对其他病原细菌或真菌有抑制活性，本研究并未涉及，所以可以进一步研究这些植物对其他病原菌的抑制活性，以便发现更多的杀菌植物，以丰富植物性杀菌剂的研究内容，为植物性杀菌剂的研究与开发提供理论依据。采取液-液萃取法跟踪分离裸芸香甲醇提取物对魔芋软腐病病原菌的抑菌活性发现，在浓度为5 mg/mL裸芸香甲醇提取物的石油醚层萃取部对魔芋软腐病病原菌的抑制活性最好，可采取色谱技术对裸芸香甲醇提取物的石油醚层萃取部进一步分离，以期分离出具有抑菌活性的单体，为新农药的研究与开发提供结构新颖的先导化合物。

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