怀黄菊微滴玻璃化超低温保存再生植株的生理和同工酶分析

2016-07-24赵喜亭蒋丽微宋萍萍朱玉婷张文芳李明军

河南农业科学 2016年5期

关键词：黄菊微滴超低温

赵喜亭，蒋丽微，宋萍萍，朱玉婷，田莹，张文芳，李明军

(1.河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007； 2.河南省高校道地中药材保育及利用工程技术研究中心，河南新乡 453007； 3.绿色药材生物技术河南省工程实验室，河南新乡 453007)

怀黄菊微滴玻璃化超低温保存再生植株的生理和同工酶分析

赵喜亭1,2,3，蒋丽微1，宋萍萍1，朱玉婷1，田莹1，张文芳1，李明军1,2,3

怀黄菊；微滴玻璃化；超低温保存；膜脂过氧化；同工酶；遗传稳定性

怀黄菊(ChrysanthemummorifoliumRamat.‘Huaihuang’)是怀菊花中的主栽优良品种，系菊科多年生宿根性草本植物，主产于河南省的武陟、温县等地(古怀庆府所辖)，是我国著名的“四大怀药”之一，具有清热、明目、疏风、解毒之功效[1]。目前怀菊花种质资源仍采用大田种植保存的方法[2]，这种方式无固定经费支持，管理粗放，再加上病虫害和自然灾害等，长期以来种质混杂，品种流失严重[3]。

超低温保存是将低温生物学和微型繁殖相结合的一种新型离体保存技术[4]。它是一种良好的种质资源保存方法，可以克服大田保存中的诸多缺点，是目前植物种质资源长期稳定保存的最有效方法。20世纪80年代发展起来的玻璃化法是其中最简便易行的方法之一[5]，与传统的方法相比，玻璃化法不需要昂贵的程序降温仪，操作简单且重演性好[6]。1989年Langis等[7]和Uragami等[8]相继证实了玻璃化法冻存植物材料的可行性。2004年Halmagyi等[9]用程序降温法、包埋脱水法、滴冻法和玻璃化法保存了9个菊花品种，结果显示玻璃化法效果最好，但没有对再生植株作遗传稳定性分析。2005年Martín等[10]比较了玻璃化法和包埋脱水法保存菊花的效果，并用RAPD标记对其再生苗做了遗传稳定性分析，结果显示，包埋脱水法保存后的效果好于玻璃化法，但包埋脱水法保存的茎尖再生苗的个别植株存在基因变异。2009年刘艳霞等[11]以中国菊花黄花小菊品种为材料，进行茎尖的玻璃化法超低温保存，成活率可达到86%，但是也没有对再生植株进行遗传稳定性分析。

本研究室对怀黄菊种质资源进行了超低温保存研究，建立了稳定的玻璃化超低温保存技术体系，并从形态和生理上证明了该体系的可行性[12]，但研究中发现，该体系的再生率较低。为了提高超低温保存后的再生率，对其微滴玻璃化法也进行了优化研究，建立了高频再生的微滴玻璃化超低温保存技术体系，旨在从生理和同工酶水平上验证微滴玻璃化法超低温保存技术不仅可以增强再生苗的抗膜脂过氧化能力，而且可以对怀黄菊种质资源进行稳定保存。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为河南省高校道地药材保育及利用工程技术研究中心(河南师范大学)常温下保存的怀黄菊试管苗(CK)和经微滴玻璃化超低温保存后的怀黄菊再生植株(RPDC)，其中CK是RPDC的母株。在培养至45 d时对CK和RPDC中上层叶片进行相关指标的测定及同工酶的电泳检测。

1.2 试验方法

1.2.2 保护酶系统相关指标的测定保护酶系统相关指标包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)的比活性等。SOD和POD比活性的测定参照宋萍萍[14]的方法；CAT、APX和GR比活性的测定参照邵换娟[16]的方法。各指标均以单株试管苗为样本，重复3次。

1.2.3 SOD、POD同工酶谱的电泳检测

1.2.3.1 粗酶液的制备分别称取CK和RPDC的叶片各0.2 g，加入0.4 mL pH值7.4的酶提取液(包含350 mmol/L蔗糖、50 mmol/L Tris、5 mmol/L抗坏血酸钠、0.25 mmol/L半胱氨酸、5 mmol/L氯化镁)，低温条件下研磨成匀浆状，4 ℃ 12 000 r/min 离心20 min，上清液即为粗酶液。

1.2.3.2 电泳本研究对SOD和POD 2种同工酶进行了分析。聚丙烯酰胺凝胶电泳参照何忠效等[17]的方法，SOD同工酶电泳上样量为28.71 μg蛋白质，POD同工酶电泳上样量为9.57 μg蛋白质；电泳时所用浓缩胶浓度为3.75%，分离胶浓度为11.25%；4 ℃下进行恒压电泳，浓缩胶和分离胶所用电压分别为100 V和150 V。SOD活性染色采用罗广华等[18]的方法，POD活性染色采用改良联苯胺染色法[17]。利用Alpha Imager 2200凝胶成像仪记录电泳后的酶谱带。

1.2.3.3 酶谱带面积的计算用Alpha Imager 2200凝胶成像系统对CK和RPDC的SOD和POD各谱带进行分析，并计算谱带面积。

1.3 数据处理

试验数据用平均值±标准差表示。采用Excel和SPSS 11.5软件进行方差分析。差异显著性比较采用t检验。

2 结果与分析

2.1 微滴玻璃化超低温保存对怀黄菊再生植株叶片中膜脂过氧化相关指标的影响

2.2 微滴玻璃化超低温保存对怀黄菊再生植株叶片中保护酶系统相关指标的影响

从表1可知，与CK相比，RPDC叶片中SOD、CAT、APX和GR比活性显著增强(P<0.05)，POD比活性有所增加。表明，经微滴玻璃化超低温保存后怀黄菊再生植株体内保持了较高的清除活性氧的能力。以上膜脂过氧化相关指标和保护酶系统相关指标的测定结果从生理水平证实了经所建立的微滴玻璃化超低温技术保存后的再生植株抗膜脂过氧化能力增强。

不同小写字母表示在0.05水平差异显著

表1 微滴玻璃化超低温保存对怀黄菊再生植株叶片中保护酶比活性的影响 U/mg

注：同行不同小写字母表示在0.05水平差异显著。

2.3 微滴玻璃化超低温保存对怀黄菊再生植株叶片中SOD、POD同工酶谱的影响

由表2、图2-A可以看出，微滴玻璃化超低温保存没有引起再生植株叶片SOD同工酶谱带条数的变化，CK和RPDC叶片均有7条酶带，分别记为 SOD-1、SOD-2、SOD-3、SOD-4、SOD-5、SOD-6、SOD-7。但在亮度上，RPDC各条酶带均比CK的相应酶带强，在面积上，RPDC各谱带也较CK的相应谱带大(表2)，即表明RPDC的SOD活性比CK的强，这与上述测定的RPDC中SOD比活性较CK显著增强的结果一致。

表2 RPDC与CK叶片中SOD和POD同工酶谱带面积分析 mm2

图2-B同样表明，微滴玻璃化超低温保存也没有引起再生植株叶片POD同工酶谱带条数的变化，CK和RPDC叶片均有7条酶带，分别记为POD-1、POD-2、POD-3、POD-4、POD-5、POD-6、POD-7。其中二者的POD-1、POD-2、POD-3和POD-5亮度相近，且对应的各谱带面积也相差不大(表2)，RPDC中POD-4、POD-6、POD-7三条酶带的亮度较CK的强，相应谱带面积也较CK的大，这与上述测定的RPDC中POD比活性较CK有所增强但没有显著增强的结果相一致。

以上分析，从同工酶水平证实了微滴玻璃化超低温保存技术不会改变怀黄菊再生植株的遗传稳定性。

图2 微滴玻璃化超低温保存对怀黄菊再生植株叶片中SOD(A)和POD(B)同工酶谱的影响

3 结论与讨论

另外，同工酶是基因的直接产物，其结构的差异反映了基因的表达差异[22]。通过SOD和POD酶谱分析发现，怀黄菊玻璃化法超低温保存后再生植株与常温植株的叶片POD酶谱、SOD酶谱均表现出高度的一致性。再生植株与常温植株谱带虽然亮度存在差异，但是谱带的数量和迁移率相同。这说明超低温保存后再生植株的基因型没有发生改变，即遗传稳定性没有发生改变。这与刘艳霞[23]在2008年采用SRAP标记对冻后分化的22株再生植株进行遗传稳定性鉴定的结论是相同的。

综上所述，本研究不仅从生理生化水平验证了玻璃化超低温保存增强了怀黄菊的抗膜脂过氧化能力，而且在POD、SOD同工酶水平上验证了玻璃化超低温保存可以对怀黄菊种质资源进行稳定保存，因此认为玻璃化超低温保存可以作为怀黄菊种质资源保存的理想方法。

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Analysis of Physiology and Isoenzyme of Regenerated Plantlets ofChrysanthemummorifolium‘Huaihuang’ Cryopreserved by Droplet Vitrification

ZHAO Xiting1,2,3,JIANG Liwei1,SONG Pingping1,ZHU Yuting1,TIAN Ying1,ZHANG Wenfang1,LI Mingjun1,2,3

(1.College of Life Science,Henan Normal University,Xinxiang 453007,China; 2.Engineering Technology Research Center of Nursing and Utilization of Genuine Chinese Crude Drugs of Henan Province of University,Xinxiang 453007,China; 3.Green Crude Drugs Biotechnology Engineering Laboratory of Henan Province,Xinxiang 453007,China)