金属硫蛋白基因MT1A在大肠杆菌中的自诱导表达条件优化及其抗镉性

王 昭，王 席，杨 威，彭 冬，柳忠玉*

(1.长江大学/湿地生态与农业利用教育部工程研究中心，湖北 荆州 434025；2.长江大学 生命科学学院， 湖北 荆州 434025)

金属硫蛋白基因MT1A在大肠杆菌中的自诱导表达条件优化及其抗镉性

王 昭1,2，王 席2，杨 威2，彭 冬2，柳忠玉1,2*

(1.长江大学/湿地生态与农业利用教育部工程研究中心，湖北 荆州 434025；2.长江大学 生命科学学院， 湖北 荆州 434025)

为了提高金属硫蛋白基因MT1A的高效表达和对重金属的抗性，以菌体密度、可溶性目的蛋白表达量为评价指标，对工程菌自诱导的培养条件(诱导时间、诱导温度)和培养基组分(蛋白胨、酵母粉、甘油、葡萄糖、乳糖)进行优化，并对其抗镉(Cd)性进行分析。结果表明，最优自诱导培养基组分为2.0%蛋白胨、2.0%酵母粉、0.3%甘油、0.05%葡萄糖、0.3%乳糖；重组菌自诱导表达最优培养条件为37 ℃培养 3 h，然后25 ℃继续培养 13 h，此时菌体密度、可溶性蛋白表达量、可溶性蛋白相对产量均最高，分别比未优化ZYM-5052培养基提高77.7%、94.0%、244.8%。当Cd2+浓度为0.5 mmol/L时，高效表达金属硫蛋白的菌株具有明显的抗Cd活性。

金属硫蛋白； 可溶性表达； 自诱导； 抗镉性

随着工农业的快速发展，大量工业废水和生活污水被排放到环境中，造成水体和土壤重金属污染日趋严重。如何有效地预防和治理重金属污染已成为亟待解决的问题[1]。对重金属污染的治理方法主要有农业生态修复、植物修复、微生物修复等。近年来，微生物修复以其高效性和安全性受到科研工作者的广泛关注，并且取得一定进展，其中包括利用微生物表达金属硫蛋白(metallothionein，MT)[2]。MT是一类普遍存在于生物体内的富含半胱氨酸、相对分子质量较低的金属结合蛋白，具有高诱导特性和多种生物学功能[3]。尤其值得关注的是，由于 MT分子结构的特异性，MT可稳定、高效地结合多种重金属，如镉(Cd)、汞(Hg)和 铅(Pb)等，因而具有显著地解除重金属毒性的能力[4]。利用微生物高效表达MT可以实现重金属的转化和清除，而微生物体内MT的表达水平与重金属转化能力密切相关[5]。

本研究中心前期为了在大肠杆菌中表达人源金属硫蛋白基因MT1A，以GST为表达标签，构建了重组工程菌株 pET20b-GS-MT1A/BL21(DE3)。但是在LB培养基中，IPTG的诱导极易形成包涵体，并且对细胞生长有抑制作用，导致细胞不能高密度生长，大大限制工程菌修复重金属污染的能力。而自诱导培养基中的乳糖无毒，乳糖作为诱导剂在表达大肠杆菌重组蛋白方面具有明显的优越性，可溶性蛋白表达量高，蛋白质产量高，成本低[6-8]。因此，本研究拟采用自诱导表达技术[9]实现MT1A基因的高产量及高活性表达，并研究重组工程菌株pET20b-GS-MT1A/BL21(DE3)对Cd的抗性， 以期为加强Cd污染的治理与修复，促进生态环境健康发展提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 表达融合蛋白 GS-MT1A的重组基因工程菌 pET20b-GS-MT1A/BL21(DE3)由暨南大学医药生物技术研究开发中心黄亚东教授惠赠。蛋白质分子量标准和 IPTG 均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 培养基 ZYM-5052培养基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉、25 mmol/L Na2HPO4、25 mmol/L KH2PO4、50 mmol/L NH4Cl、5 mmol/L Na2SO4、2 mmol/L MgSO4、 0.5%甘油、0.05%葡萄糖、0.2%乳糖。LB培养基 ：1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉、1%NaCl。

1.2 菌体培养基及培养条件的优化

1.2.1 培养基的对比 挑取工程菌 pET20b-GS-MT1A/BL21(DE3)的单菌落接种到含5 mL LB培养基的试管中，在37 ℃、200 r/min条件下培养14 h作为种子液。然后按1∶100接种到摇瓶中，分别加入新鲜 LB 培养基、ZYM-5052 自诱导培养基，在 37 ℃条件下培养24 h。其中，LB 培养基中菌体培养至 OD600值达到 0.5时(大约3 h)，加入终浓度为 0.5 mmol/L 的 IPTG进行诱导。检测不同培养时间菌体OD600值，绘制生长曲线，并在培养终点测定可溶性蛋白表达量，计算相对产量。

1.2.2 培养温度的选择 以 1%的接种量将种子液接种到ZYM-5052培养基中，首先在37 ℃培养3 h ，然后分别在30、25、20 ℃继续培养17 h。以在ZYM-5052培养基中 37 ℃恒温培养 20 h 作为对照。发酵结束时测定菌体密度(OD600)和可溶性蛋白表达量，并计算相对产量。

1.2.3 培养时间的选择 采用两阶段温度进行培养， 37 ℃培养3 h，然后降温至25 ℃继续培养，分别在降温后1、5、9、13、17 h取样检测菌体OD600和可溶性蛋白表达量，并计算相对产量。

1.2.4 ZYM-5052培养基组分的优化 选取蛋白胨、酵母粉、乳糖、甘油、葡萄糖 5 个因素，每个因素选取 4 个水平，采用L16(45)正交试验进行优选(试验设计见表1)。以1%的接种量将种子液接种于培养基中，在最优培养条件下培养，培养结束后以可溶性蛋白相对产量为指标筛选最优组合。

表1 优化培养基组分的正交试验设计 %

1.3 可溶性蛋白表达量的测定

培养结束后收集菌体，加入1/20菌液体积的PBS悬浮菌体，冰上超声裂解， 12 000×g离心10 min，分别收集上清和沉淀，进行 12% SDS-PAGE电泳。经凝胶光密度扫描分析融合蛋白GS-MT1A的可溶性蛋白表达量，并计算可溶性蛋白的相对产量。相对产量=OD600×可溶性蛋白表达量。

1.4 重组工程菌的抗Cd性测定

以空载体菌株pET20b/BL21(DE3)为对照菌株，考察重组工程菌 pET20b-GS-MT1A/BL21(DE3)在优化后的ZYM-5052培养基、培养条件下的抗Cd性。当菌体 OD600值达到 0.5时，加入Cd(NO3)2使Cd2+的终浓度分别为0、0.1、0.5 mmol/L。每隔1 h取一次样测OD600，培养直到出现平台期。

2 结果与分析

2.1 2种菌体生长培养基的对比分析

由图1和图2可见，在IPTG诱导的 LB 培养基中， pET20b-GS-MT1A/BL21(DE3)重组基因工程菌在 0～6 h 菌体密度呈对数增长，10 h后菌体密度不再增加，培养终点菌体OD600为2.21，可溶性蛋白表达量为 9.2%，可溶性蛋白相对产量为20.24%；在ZYM-5052自诱导培养基中，pET20b-GS-MT1A/BL21(DE3)重组基因工程菌在 0～6 h 菌体密度呈对数增长，10 h 后菌体密度继续增长，培养终点菌体 OD600为 2.78，可溶性蛋白表达量为 10.21%，可溶性蛋白相对产量为28.38%。由此可见，同LB培养基相比，ZYM-5052 培养基更适合菌体密度的提高和可溶性蛋白的表达，后续试验将对该菌在ZYM-5052培养基中的培养条件及培养基组分进行优化。

图1 pET20b-GS-MT1A/BL21(DE3)重组基因工程菌生长曲线

图2 不同培养基对重组基因工程菌密度和可溶性蛋白表达量的影响

2.2 菌体培养条件的优化结果

2.2.1 培养温度 由图3可见，随着培养温度的降低，可溶性蛋白表达量明显提高，可溶性蛋白相对产量在 25 ℃ 时最大，此时菌体OD600为2.38，可溶性蛋白表达量为18.3%，比37 ℃恒温培养提高了79.2%。由此可见，同37 ℃恒温培养相比，两阶段温度培养的可溶性蛋白表达量大幅度提升，后续试验选择两阶段温度控制进行培养，培养条件为37 ℃培养3 h，25 ℃继续培养。

A.37 ℃恒温； B.两阶段温度37 ℃/30 ℃；C.两阶段温度37 ℃/25 ℃； D.两阶段温度37 ℃/20 ℃图3 不同培养温度对重组基因工程菌密度和可溶性蛋白表达量的影响

2.2.2 培养时间 由图4可知，随着培养时间的延长菌体密度逐渐增大，可溶性蛋白表达量和可溶性蛋白相对产量均先升高后趋于平稳，在13 h时最高。因此，确定培养条件为 37 ℃培养3 h，降温至25 ℃后继续培养 13 h。

图4 不同培养时间对重组基因工程菌密度及可溶性蛋白表达量的影响

2.3 ZYM-5052培养基的优化结果

2.3.1 培养基组分的正交试验优化 由表2可知，培养基对可溶性蛋白相对产量的影响顺序为C>B>D>E>A，即5种因素的重要性依次为乳糖> 酵母粉>甘油>葡萄糖>蛋白胨。优化的培养基组分组合为A4B4C4D1E2，即2.0%蛋白胨、2.0%酵母粉、0.3%乳糖、0.3%甘油、0.05%葡萄糖。

2.3.2 ZYM-5052优化培养基的验证 用优化后的 ZYM-5052 自诱导培养基对重组基因工程菌进行自诱导发酵，并以 IPTG诱导的 LB 培养基、文献[5]中的ZYM-5052自诱导培养基为对照进行比较，结果见表 3。用优化后的自诱导培养基发酵获得的菌体密度、可溶性蛋白表达量、可溶性蛋白相对产量均最高，分别比未优化ZYM-5052培养基提高77.7%、94.0%、244.8%，比LB 培养基(IPTG 诱导)提高124.5%、115.3%、383.5%。

表2 优化培养基组分对可溶性蛋白相对产量的影响

表3 培养基优化前后培养重组基因工程菌效果的比较

2.4 重组基因工程菌的抗Cd性

在优化后的ZYM-5052培养基和培养条件下，以pET20b/BL21(DE3)作为对照菌，检测重组菌pET20b-GSMT/BL21(DE3)对Cd的抗性，结果如图5所示。当Cd2+浓度≤0.1 mmol/L时，重组菌pET20b-GSMT/BL21(DE3)和对照菌pET20b/BL21(DE3)的生长没有明显的差异，菌液密度总体随处理时间延长逐渐增加 。当Cd2+浓度为0.5 mmol/L时，在处理4 h 后对照菌的生长开始明显受到抑制，而重组菌的生长依旧保持较大增长趋势，说明该重组菌株具有明显的抗Cd2+活性。

图5 不同Cd2+浓度下重组基因工程菌的生长情况

3 结论与讨论

自诱导培养基已经成功应用于多种酶和蛋白的高效表达[10-11]。本研究中心组前期构建了表达人源金属硫蛋白基因MT1A的重组工程菌pET20b-GSMT/BL21(DE3)，但是目的蛋白在LB培养基(IPTG诱导)中以包涵体的形式表达，而且菌体密度低，因此，本研究探讨了在ZYM-5052 培养基中高效自诱导表达金属硫蛋白的可行性。

与单一温度培养模式相比，在变温培养模式下可溶性蛋白表达量明显提高。张芙华等[12]提出，利用枯草芽孢杆菌(Bucillussubtilis)分批发酵生产角质酶的两阶段温度控制策略，采用该策略最高酶活比37 ℃恒温培养提高了83.4%。本研究采用两阶段温度培养，即37 ℃培养3 h，降温至25 ℃继续培养13 h，结果表明,可溶性蛋白表达量比37 ℃恒温培养提高了79.2%。两阶段温度调控策略有助于提高蛋白质的可溶性表达，可能是由于先在 37 ℃下培养增加菌体量，然后低温培养减缓重组蛋白的合成速率以促进蛋白质正确折叠[12]。

通常使用的LB培养基组成成分简单，不能满足高密度发酵对营养的要求。而自诱导培养基中的乳糖既可以作为能源促进细胞高密度生长，也可以作为诱导剂提高细胞活性和蛋白质表达量，使菌体密度和可溶性蛋白表达量增加数倍[13]。丛楠等[14]对自诱导培养基成分优化后发现，菌体密度和重组毒素IL-6表达量分别是优化前的1.76 倍和 2.12 倍。本研究通过正交试验对ZYM-5052自诱导培养基成分进行了优化。优化后培养基成分为： 2.0%蛋白胨、2.0%酵母、0.3%乳糖、0.3%甘油、0.05%葡萄糖，用优化后的自诱导培养基发酵获得菌体密度、可溶性蛋白表达量、可溶性蛋白相对产量均最高，分别比未优化ZYM-5052培养基提高77.7%、94.0%、244.8%，分别比LB 培养基(IPTG 诱导)提高124.5%、115.3%、383.5%。由此可见，在ZYM-5052 培养基中高效自诱导表达金属硫蛋白是可行的。另外，乳糖自诱导表达系统既保证了蛋白质表达的稳定性，同时自诱导发酵过程中无需检测菌体的生长状态，避免了不必要的污染，并且节省成本[15-16]。

金属硫蛋白主要包含MT-Ⅰ、MT-Ⅱ、MT-Ⅲ和MT-Ⅳ4种异构体，又可以划分为多个功能亚型，例如MT-ⅠA、MT-ⅠB、MT-ⅠE、MT-ⅠF、MT-ⅠG、MT-ⅠH、 MT-ⅠX、MT-ⅡA等。徐玉凤等[17]将水稻的10 个水稻 I 类 MT 基因在锌(Zn) 和 Pb的酵母敏感突变体中异源表达，结果表明，表达水稻Ⅰ类 MT 基因的酵母细胞都在一定程度上提高了对Zn和 Pb 的耐受性。李华玲等[18]研究显示，表达小鼠MT1 和MT2基因的大肠杆菌菌株对重金属铜(Cu)的抗性明显提高。李敏等[19]发现，与野生菌株相比，表达人源金属硫蛋白基因mt的酿酒酵母细胞对Pb的吸附量提高了11%。许黎明等[4]研究显示，人金属硫蛋白基因MT1E的表达有助于提高酿酒酵母细胞对铬(Cr)离子的抗性，而对Cu、Zn、锰(Mn)、钴(Co)的抗性没有明显改善。由此可见，不同物种及不同亚型的MTs 对重金属的解毒能力各不相同。本研究中高表达人源金属硫蛋白基因MT1A的菌株具有明显的抗Cd 活性，该菌株对其他重金属离子的抗性以及抗性机制还有待进一步开展，该菌株有望在重金属解毒和修复重金属污染的环境中发挥作用。

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Optimization of Auto-induction Expression Conditions of Metallothionein GeneMT1AinEscherichiacoliand Its Cadmium Tolerance

WANG Zhao1,2,WANG Xi2,YANG Wei2,PENG Dong2,LIU Zhongyu1,2*

(1.Engineering Research Center of Ecology and Agricultural Use of Wetland,Ministry of Education/Yangtze University, Jingzhou 434025,China; 2.College of Life Sciences,Yangtze University,Jingzhou 434025,China)

In order to increase the protein yield and heavy metal resistance of metallothionein geneMT1A，auto-induction medium composition(tryptone,yeast extract,glycerol,glucose and lactose) and culture conditions(induction time and temperature) were optimized with bacterial density and expression level of soluble target protein as evaluation indexes,and the Cd tolerance was detected. The results showed that the optimal auto-induction medium composition were 2.0% yeast extract,0.3%glycerol,0.05%glucose,0.3% lactose.The optimum culture conditions were cultivating in 37 ℃ for 3 h firstly,then culturing in 25 ℃ for 13 h.Under the optimal condition,the bacterial density,the expression level and relative yield of soluble protein increased by 77.7%,94.0%,244.8%,respectively,compared to the unoptimized ZYM-5052 medium.Furthermore，the engineered bacteria had an obvious resistance to 0.5 mmol/L Cd2+.

metallothionein; soluble expression; auto-induction; Cd resistance

2015-12-24

长江大学湿地生态与农业利用教育部工程研究中心开放基金项目(KF201511)；长江大学大学生创新创业训练计划项目(104892013034)

王 昭(1991-)，男，湖北仙桃人，在读本科生，研究方向：环境生物技术。 E-mail:594226195@qq.com

*通讯作者：柳忠玉(1978-)，女，湖北潜江人，讲师，博士，主要从事环境污染与生态修复方面的研究。 E-mail:zyliu2004@126.com

X171.5;Q78

A

1004-3268(2016)05-0066-05