脓毒症患者血小板微粒与微RNA-155水平的变化规律及意义*

杨婉花，张宏泽，刘鸿翔，刘长芳，叶冬英，石 斌△，刘景全

(1.上海交通大学附属第一人民医院松江分院急诊危重病科，上海 201600；2 浙江省人民医院ICU，浙江杭州 310014)

论著·临床研究

脓毒症患者血小板微粒与微RNA-155水平的变化规律及意义*

杨婉花1，张宏泽1，刘鸿翔1，刘长芳1，叶冬英1，石 斌1△，刘景全2

(1.上海交通大学附属第一人民医院松江分院急诊危重病科，上海 201600；2 浙江省人民医院ICU，浙江杭州 310014)

目的 探讨血小板微粒(PMPs)和微RNA(miRNA)-155与脓毒症患者病情和预后的关系。方法 选择脓毒症患者61例，根据28 d预后将其分为存活组和死亡组；根据病情严重程度将其分为脓毒症组、严重脓毒症组及脓毒症休克组。比较各组患者APACHEⅡ评分，使用流式细胞仪进行PMPs定量，利用实时荧光定量PCR检测患者血浆miRNA-155水平。Spearman相关性分析确认PMPs水平、miRNA-155水平与患者APACHEⅡ评分的关系。结果 与存活组比较，死亡组患者PMPs水平较高(P<0.05)。脓毒症、严重脓毒症、脓毒症休克3组患者的PMPs水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。死亡组患者的miRNA-155水平相对于存活组提高(P<0.05)，严重脓毒症组及脓毒症休克组患者的miRNA水平较脓毒症组明显提高(P<0.05)。患者PMPs水平及miRNA-155水平均与APACHEⅡ评分呈正相关，同时患者PMPs水平与microRNA-155水平也呈正相关。PMPs水平联合miRNA-155水平预测脓毒症患者死亡的ROC曲线下面积达0.831。结论 脓毒症患者的PMPs水平及miRNA-155水平与脓毒症患者的病情及预后有关，miRNA-155可能引起脓毒症患者的PMPs水平增高。

脓毒症；血小板微粒；微RNAs；预后

脓毒症的发病机制和病理、生理过程十分复杂，涉及内皮损伤、炎症反应、免疫功能紊乱以及凝血功能紊乱等诸多环节[1]。既往研究多关注炎症反应中的指标，诸如白细胞介素(IL)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)等的变化，或者血流动力学指标以及凝血功能等指标的变化[2]。近期，大量研究开始关注血小板微粒(platelet microparticles,PMPs)在脓毒症发生及发展过程中的作用，PMPs是从活化的血小板表面脱落的微小颗粒，除介导凝血功能外，还可参与炎症因子的释放及调节血管的舒缩功能，因而在脓毒症中发挥重要作用[3]，但关于PMPs和脓毒症患者病情及预后关系的报道还较少见，分子生物学机制也尚未清楚。微RNA(microRNA，miRNA)是广泛存在于真核生物体内的非编码短链RNA，可通过沉默靶基因的表达实现生物调控作用，因此其与多种疾病有关，是近年来热门的分子生物指标。大量研究表明，脓毒症患者存在miRNA的表达变化，miRNA在脓毒症的发生、发展过程中，除了具有免疫调节和炎性调控作用外，还可能通过调节血小板的活化来影响脓毒症的进展[4-5]。近期，关于miRNA-155的研究较多，既往研究已经证实脓毒症中存在miRNA-155的高表达[6]，但是在脓毒症中，miRNA-155是否影响血小板的活化，是否与PMPs有关，还不得而知。因此，本研究探讨脓毒症患者预后与PMPs的关系，并进一部证实miRNA-155在此过程中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年5月至2014年10月上海交通大学附属第一人民医院松江分院急诊危重病科收治的脓毒症患者61例，其中男38例，女23例，平均年龄(56.00±8.00)岁。纳入对象均依据美国胸科医师学会和美国危重病医学会在2001年华盛顿国际脓毒症会议中制定的定义确诊为脓毒症。排除标准：(1)年龄小于18岁；(2)急性心肌梗死、心源性休克；(3)心、肝、肾、肺等既往存在严重的慢性疾病；(4)近期服用过抗血小板药、降糖药、调脂药等对血小板活化有影响的药物；(5)入院前使用大量儿茶酚胺类药物；(6)因各种原因中途放弃治疗及入住ICU后24 h内死亡。

1.2 方法

1.2.1 患者分组 依照国际严重脓毒症和脓毒症休克管理治疗指南(2012年版)建议的方法对患者进行规范化治疗。根据治疗28 d的预后将纳入对象分为存活组(n=40)和死亡组(n=21)。根据病情的严重程度，将研究对象分为脓毒症组(n=21)、严重脓毒症组(n=15)及脓毒症休克组(n=25)。各组患者的年龄、性别、感染部位、病史等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2.2 观察指标 (1)常规记录患者的性别、年龄、病史、感染原因，监测患者体温、呼吸、心率、血流动力学指标等生命体征。计算入院24 h内急性生理学和慢性健康评分Ⅱ(APACHEⅡ)。(2)采集患者脓毒症诊断成立后12 h内静脉血标本(以晨起空腹静脉血最佳)3.00 mL，枸橼酸抗凝，低速离心后分离血浆标本。使用FACSort流式细胞系统检测PMPs，按照马文新等[7]报道的标准微球法定位法处理血浆标本、设定流式细胞仪参数并按所报道公式计算血浆标本中的PMPs的绝对量。荧光标记采用FITC-CD61(FITC标记的抗血小板膜糖蛋白GPⅢa抗体，购自美国贝克曼库尔特公司)。(3)采集脓毒症诊断成立的12 h内患者静脉血，使用MiRcute miRNA 提取分离试剂盒(购自北京天根生物科技有限公司)，按照厂商说明书中方案提取血浆标本中的miRNA，测定纯度和浓度后，使用TaqMan MicroRNA反转录试剂盒(购自美国Life Technologies公司)将获取的miRNA反转为cDNA，反转录体系和条件按照厂商说明书设置。对获得的cDNA进行qRT-PCR扩增，试剂盒采用GoTaq qPCR Master Mix(购自北京普洛麦格生物技术有限公司)，反应体系和条件参考说明书。相关引物序列参考文献[8]进行设计，其中，miRNA-155上游引物序列：5′-CGT TAA TGC TAA TCG TGA TAG-3′，下游引物：5′-GCA GGG TCC GAG G-3′；使用U6 snRNA 作为内参，其上游引物序列： 5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。以2-△△c t表示各组miRNA-155相对于对照组(脓毒症组或存活组)的表达水平，△ct=ct目标-ct内参。

2 结 果

2.1 PMPs与脓毒症患者病情及预后的关系 流式细胞仪分析发现，脓毒症组患者的PMPs水平为(6.25±0.19)×105/mL，严重脓毒症组患者的PMPs水平为(7.12±0.31)×105/mL，两组比较差异有统计学意义(t=7.01，P<0.05)。脓毒症休克组患者的PMPs水平最高，为(8.17±0.22)×105/mL，与脓毒症组及严重脓毒症组比较，差异均有统计意义(t=6.42、2.33，P<0.05)。预后方面，存活组患者的PMPs水平为(6.58±0.25)×105/mL，死亡组患者的PMPs水平为(8.53±0.18)×105/mL，两组比较差异有统计学意义(t=2.61，P<0.05)。相关性分析发现，患者PMPs水平与APACHEⅡ评分呈正相关(r=0.68，P<0.05)，见图1。该结果提示较高PMPs水平的脓毒症患者病情较重，预后较差。

图1 PMPs水平与APACHEⅡ评分的关系

2.2 miRNA-155与脓毒症患者病情及预后的关系 相对于脓毒症组患者，严重脓毒症患者的miRNA-155水平提高了(1.41±0.03)倍，两组比较差异有统计学意义(t=10.03，P<0.05)。脓毒症休克组患者的miRNA-155水平最高，相对于脓毒症组患者，提高了(1.72±0.06)倍，两组比较差异有统计意义(t=10.05，P<0.05)。预后方面，死亡组患者的miRNA-155水平相对于存活组提高了(1.51±0.04)倍，两组比较差异有统计学意义(t=14.83，P<0.05)。若以2-ΔΔct表示各组miRNA-155的水平，相关性分析发现，患者miRNA-155水平与APACHEⅡ呈正相关(r=0.62，P<0.05)，见图2。提示较高miRNA-155水平的脓毒症患者病情较重，预后较差。

图2 miRNA-155水平与APACHEⅡ评分的关系

2.3 PMPs与miRNA-155水平及二者联合预测脓毒症患者预后的价值 相关性分析发现，患者PMPs水平与miRNA-155水平呈正相关(r=0.68，P<0.05)，见图3。使用APACHEⅡ评分、PMPs、miRNA-155及PMPs联合miRNA-155指标预测脓毒症患者的预后,见图4，4种指标的ROC曲线下面积分别为0.691(95%CI：0.533～0.849，P<0.05)，0.716(95%CI：0.558～0.873，P<0.05)，0.831(95%CI：0.693～0.970，P<0.05)，0.831(95%CI：0.693～0.970，P<0.05)。PMPs预测脓毒症患者预后的临床价值与传统的APACHEⅡ评分类似，但联合miRNA-155指标后，其临床价值更佳。

图3 microRNA-155水平与PMPs计数的关系

图4 4种指标预测脓毒症患者死亡的ROC曲线

3 讨 论

PMPs是血小板再活化过程中从脂膜表面释放的一种超微膜性囊泡，直径在1 μm以下，它可以促进血栓的形成与延伸，并进一步活化血小板。研究认为PMPs是血小板信息传递的载体，可参与血栓性疾病和炎性疾病[9]。脓毒症作为感染引起的全身炎症反应，有可能存在PMPs的表达异常。但是由于检测技术的局限性，很难对PMPs进行检测计数，因此长期以来，PMPs在脓毒症中的实践应用较少有报道。近年来，随着流式细胞术及生物标记技术的发展，PMPs的定量检测已经变得具有可行性[10]。

本研究通过流式细胞术对脓毒症患者的PMPs进行了定量，发现病情严重或者预后较差的脓毒症患者PMPs水平较高，意味着过多的PMPs不利于脓毒症患者的预后。结合既往文献，本研究认为过量PMPs影响脓毒症患者病情和预后的可能机制为：(1)PMPs表面的磷酯酰丝氨酸为凝血酶原复合物提供了催化表面，其带负电的磷脂表面也为凝血因子提供了结合位点，大量的PMPs出现造成凝血功能紊乱，导致凝血亢进，形成广泛的微血栓，增加微循环障碍和休克风险，其次继发的纤溶亢进也可威胁脓毒症患者生命。(2)PMPs可以参与内皮源性及单核源性细胞因子的释放，比如造成IL、TNF-α的失控，造成脓毒症患者进一步的炎症反应失控。(3)PMPs引起的炎症因子释放可以造成内皮损伤，而内皮损伤是脓毒症中关键的病理生理现象，如损伤的内皮增加血栓形成风险，影响血管收缩调控因子释放紊乱，引起血管通透性的增加，进而导致炎性物质的扩散。(4)PMPs可作为细菌传播的载体，过多的PMPs增加了细菌播散的风险[11-13]。

另外，除了关注PMPs水平外，本研究还关注了脓毒症患者miRNA-155的水平变化。因为近期关于脓毒症和miRNA关系的研究比较热门。研究证实一些miRNA可调控炎症通路来影响炎症反应的强度，从而影响脓毒症的发生、发展。如有研究表明miRNA-9可以降低NF-κB活性，发挥促炎作用，不利于脓毒症的预后[14]。至于miRNA-155，有研究发现在脓毒症小鼠模型中，miRNA-155可以提高TNF-α，促进炎症反应，导致脓毒症小鼠的高病死率[15]。还有研究指出，miRNA-155可以调节脓毒症患者的T细胞亚群比例，使具有免疫抑制功能的调节性 T 细胞比例增加，从而导致患者免疫抑制，引起较差的预后[16]。虽然各研究中miRNA-155的作用机制不同，但miRNA-155对脓毒症的影响是一致的，即引起较差的预后。本研究发现病情较重、预后较差的脓毒症其miRNA-155水平较高，也证明miRNA-155在脓毒症中扮演一定的角色，其高表达是预后不良的危险因素。这与既往研究基本一致。本研究还将miRNA-155水平与PMPs水平联系起来，发现miRNA-155水平与PMPs定量水平呈正相关，提示脓毒症中较高的miRNA-155可能引起患者PMPs过度增多，过多的PMPs再通过上述的4个机制影响患者预后。同时本研究认为miRNA-155可能通过刺激血小板活化，进而增加了PMPs水平。一些研究已经证实了miRNA具有调节活化血小板的作用，如Bender等[17]认为miRNA主要通过调节PI3K/Akt信号通路来实现对血小板活化的调节。当然在脓毒症中，miRNA-155是如何调节血小板活化并增加PMPs的，还有待研究。总之，本研究认为过高的PMPs定量水平和miRNA-155水平提示脓毒症患者预后不良，miRNA-155可能增加PMPs的释放。

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Change rule and significance of platelet microparticles and microRNA-155 level in patients with sepsis*

YangWanhua1,ZhangHongze1,LiuHongxiang1,LiuChangfang1,YeDongying1,ShiBin1△，LiuJingquan2

(1.DepartmentofEmergencyCriticalDisease,SongjiangBranchHospital,FirstAffiliatedPeople′sHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai201600,China;2.ICU,ZhejiangProvincialPeople′sHospital,Hangzhou,Zhejiang310014,China)

Objective To investigate the relationship between platelet microparticles(PMPs) and microRNA-155 with the disease condition and prognosis in the patients with sepsis.Methods 61 patients with sepsis were selected and divided into the survival group and the death group according to the 28 d prognosis.And all cases were divided into the sepsis group,severe sepsis group and sepsis shock group according to the severity of sepsis.The APACHEⅡ scores were compared among various groups.The Spearman correlation analysis was used to determine the correlation between the levels of PMPs and miRNA-155 with the APACHEⅡ scores.The plasma PMPs level was quantitatively detected by the flow cytometry and the plasma miRNA-155 level was detected by the quantitative RT-PCR.The Spearman correlation analysis was performed to determine the relationship between the PMPs and microRNA-155 level with the APACHEⅡscore.Results The PMPs level in the death group was higher than that in the survival group(P<0.05).The PMPs level had statistical differences among the sepsis group,severe sepsis group and sepsis shock group(P<0.05).The miRNA level in the death group was higher than that in the survival group(P<0.05),the miRNA level in the severe sepsis group and the sepsis shock group was increased compared with the sepsis group(P<0.05).The levels of PMPs and miRNA-155 were positively correlated with the APACHEⅡscore,meanwhile,the PMPs level in the patients was positively correlated with microRNA-155 level.The area under curve(AUC) of ROC curve in the PMPs combined with miRNA-155 for predicting the death of sepsis patients reached 0.831.Conclusion The PMPs and miRNA-155 levels are correlated with the disease condition and prognosis in the patients with sepsis.miRNA could cause the increase of PMPs level in sepsis patients.

sepsis;platelet microparticles;microRNAs;prognosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.05.014

上海市松江区卫生局领先专业课题资助项目(2011SJGG27)。 作者简介：杨婉花(1971-)，副主任医师，大学本科，主要从事重症医学、重症心血管疾病诊治的研究。△

，Tel：18918288036；E-mail：shib_shanghai@163.com。

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1671-8348(2016)05-0622-03

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2015-10-14)