中药抗细菌感染机理之浅见

杨赛，郭俏，段康民

(西北大学生命科学学院，西部资源与现代生物技术省部共建教育部重点实验室，陕西 西安 710069)

中药抗细菌感染机理之浅见

杨赛，郭俏，段康民Δ

(西北大学生命科学学院，西部资源与现代生物技术省部共建教育部重点实验室，陕西 西安 710069)

抗生素的发现和使用是人类医学史上最重要的突破之一。但由于病原菌耐药性的蔓延，传染病再次对人类健康构成巨大的威胁。中药蕴藏着大量生物活性物质，是新型抗生素开发的独特而重要的资源。尽管有些传统中药有明确的临床使用效果，中药抗菌成分的临床应用却极少，其作为抗生素药品在国际医药界使用的情况甚少。结合本实验室研究结果，本研究阐述了中药抗细菌感染的新的分子机理。不同于传统抗生素通过抑菌、杀菌而发挥作用，一些传统中药的有效成分实则是“抗致病药物”，这类抗感染成分在临床上具有病原菌产生抗性几率低、对正常菌群影响小等优势。

中药成分；抗致病药物；抗生素；病原菌；药物靶点

不断出现的新病原体以及病原体抗药性的蔓延，已对人类健康构成巨大威胁。世界卫生组织发布的“世界抗结核药物的抗性”报告指出，多重抗药性结核已在世界范围流行，在45个国家(包括我国)存在对几乎所有可用药物具有抗性的结核[1]。多重抗药性的铜绿假单孢菌和耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)等引起的医院内感染更是相当普遍。对大多数甚或所有的现有临床抗生素都有抗性的超级菌(super bugs)也已出现。更严重的是，使用新研制的以杀菌或抑菌为作用方式的抗生素，病原菌会不可避免地出现抗药性[2]。普遍存在的交叉抗药性，使多种抗生素同时失效。

中药作为抗细菌感染药物，上千年的医疗应用可以说明其有效。青蒿素类抗疟疾药物是中药作为抗微生物药品的一个成功例子。它们来源于植物甜蒿木或青蒿，青蒿素最初于1971年在我国发现[3]。青蒿素对疟源寄生虫包括对其他药品有抗性的疟源虫作用迅速、有效。在副作用极小的情况下，可以降低血液中寄生虫的数量而迅速退热。这些化合物在nM浓度范围内比其它任何抗疟疾药物都更迅速地阻止寄生虫的新陈代谢并杀死疟原虫[4]。青蒿素类抗疟疾药物早已成为抗疟疾药物的中流砥柱。2015年我国科学家屠呦呦因青蒿素的发现而获得诺贝尔生理及医学奖，使中药再度成为人们关注的热点。但迄今为止，中药中的抗生素成分及机理尚未被充分研究。虽然，近年来的研究发现，中药中具有抗菌作用的化合物有多种，然而真正有效、可作为临床用药的成分却不多。作为抗细菌感染药品在国际医药界使用的中药成分迄今为止近乎不存在。检索传统中药成分数据库(TCMD中药化学数据库)中从3922种中药和药用植物中提取的9127种化合物，发现有135个化合物具有抗金黄色葡萄球菌活性，却没有任何一种成分应用于临床治疗金黄色葡萄球菌感染。普遍存在的问题是抗菌效果不佳，很多是在高浓度下才表现出抗菌性能；其他问题则是体外有抗菌性能，而体内没有效果或毒性太大。为什么中药抗菌作用明确，却找不到确实有效的抗菌成分？有关中药抗细菌感染的药效机理的研究更是匮乏。造成这一现象的原因可能是由于传统的中药抗生素成分研究受其思维模式和技术手段所限造成的。

1 抗细菌感染的新途径

传统抗生素的作用方式是通过不同靶点，抑制病原菌生长或杀死病原菌。最常见的靶点是核糖体、细胞膜和细胞壁及核酸等，抗菌机制主要包括干扰蛋白质的合成、抑制细菌细胞壁的合成、破坏细胞膜以及抑制核酸的转录或复制等。但是，近年来的研究表明控制病原菌的感染，可以有其它的途径。以病原菌致病因子及其调控途径为靶点，旨在控制病原菌致病能力的新型抗感染途径近年来正引起极大关注，呈现无限的潜力。

病原菌的致病性取决于其产生的一系列致病因子或称毒性因子。它们的作用是帮助病原菌进入宿主、使病原菌逃避宿主免疫反应或是导致宿主组织损坏直接造成病症。这些包括帮助病原菌扩散或破坏宿主组织的酶类，起黏附作用的纤毛，内、外毒素以及生物被膜形成相关因子等。抑制这些致病因子的表达或功能，将会阻止病原菌对人体的破坏，从而控制病原菌引起的感染。

同时，病原菌细胞之间的信号传递系统往往是调节病原菌致病性的枢纽[5]，它控制着病原菌的致病因子表达及生物被膜的形成，尤其是在慢性感染和难以治愈的感染中，病原菌的致病因子和致病过程呈现群体表达特性，受有多细胞特性的群体行为所控制。以上是造成慢性感染治疗失败的重要原因[5]。细菌细胞之间的信号传递系统中，“群体感应调节系统” (quorum sensing，QS)是一个依赖于细胞数量的基因调控系统[7]。系统中的自导物(autoinducer 或AI)随细胞的数量增加而变化，当细胞达到一定数量，系统中的自导物达到一定的域值时可以与一类转录调节蛋白结合，开始诱导或抑制数量众多的基因表达，使细菌表现多细胞特性的群体行为。在革兰氏阴性菌中最常见的自导物是酰基高丝氨酸内酯类(acyl-homoserine lactone)分子，而在革兰氏阳性菌中则是短肽类。而不同细菌种类之间还存在所谓“通用群体感应调节系统”。这一系统的信号分子由luxS基因产物合成，是一类4,5-dihydroxy-2,3- pentanedione (DPD)的自催化衍生物[8-10]，称作二型自诱导物(AI-2)。微生物细胞间的信息传递系统控制着包括次生代谢物的生产、细胞外分泌物的生成等重要细胞功能。在病原菌中群体感应调节系统调控致病因子的表达及生物被膜的形成[5]。而人体中80%的感染可能涉及生物被膜。在生物被膜中，病原菌的抗药性比游离状要高50～5000倍[11]。生物被膜的形成及发育受群体感应调节系统控制。因此，病原菌细胞之间的信号传递对病原菌致病过程至关重要，阻断这一过程可以使病原菌失去致病能力。

针对致病因子及其调控系统的新型抗生素或称“抗致病药物”不仅可以控制感染，而且因其不对病原菌生存产生选择压力，病原菌将不太可能产生抗药性。同时，这类药物将不会像传统抗生素那样影响人体的正常微生物群体，而这些正常微生物群体对人体健康有着不可忽视的作用[12-13]。

2 中药抗细菌感染的新机理

由于中药的特性，中药在使用时往往是几种全药混合使用，药物成分极为复杂。所以，中药疗效很多情况下是复合成分作用，数种成分共同作用达到单个成分起不到的作用效果；而另一些情况下，有效成分可能是体内代谢后生成的新化合物起作用。这些不仅是中药抗生素成分研究的难题，也是整个中药现代化研究需要解决的问题。除此之外，本课题组的前期研究结果揭示[14-15]，就中药抗感染机理而言，有些中药具有鲜为人知的“抗致病”功能，真正起作用的并非其传统的抗菌、抑菌功能。换言之，传统研究方法和思维方式在某种意义上使得一些中药的真正作用机理不被了解，因而其真正的有效成分也许被遗漏掉了。

本课题组以77种与“清热解毒”有关的中药为对象 (见表1)，使用传统的水提取和醇提取方法提取浓缩其化合物，对铜绿假单胞菌典型的的致病因子基因和群体感应基因进行筛选测试。铜绿假单胞菌是一个机会致病菌，其致病因子基因的研究比较深入，它又是研究群体感应系统的模式菌。铜绿假单胞菌可以在人群中引起严重感染，是患者在医院期间发生感染的最主要的病原菌之一。在最近美国传染病学会(IDSA)的大型抗生素可用性研究(The Antimicrobial Availability Task Force)确认的几个对人类健康威胁最大、但针对性药物研究又很少的病原菌中，铜绿假单孢菌为其一[16]。铜绿假单孢菌尤其容易感染器官移植、烧伤、免疫系统受抑制的患者，如癌症和艾滋病患者等，并常常可以造成患者死亡。铜绿假单胞菌的一个重要特性是它对许多抗生素具备很高的内在抗药性[17]，使其成为难以治疗的病原菌。铜绿假单胞菌也是研究细菌致病性和抗药性的重要对象。铜绿假单胞菌的致病性由为数众多的包括外毒素、弹性蛋白酶、溶血素等在内的致病因子决定，同时它有3种不同的群体感应调节系统：酰基高丝氨酸内酯为基础的las和rhl系统以及喹诺酮为基础的PQS(Pseudomonas Quinolone Signal)系统。这些群体感应调节系统调控着大部分已知致病因子的表达。

表1 制备水提取物和醇提取物的中药的名单

对这些中药提取物的筛选结果表明，本课题组所选的中药绝大多数都含有影响致病因子基因或群体感应基因表达的成分。图1所示是20种中药对7个代表性致病因子的影响结果。可见每一种中药的水提物或是其醇提物或是二者都至少对一个致病因子有调控作用。

图1 20种中药的水提及醇提物对铜绿假单胞菌代表性致病因子基因表达调控的热点图绿色为抑制，红色为促进，黑色为没有影响，颜色深浅表示影响程度；W：水提物，Eth：醇提物Fig.1 The heat map that the expression regulation of Pseudomonas aeruginosa representative pathogenic factor gene under the work of 20 kinds Chinese herbs water and alcohol extractGreen, suppress; red, promote; black, no effect; the degree of the color indicates the degree of influence; W: water extract, Eth: alcohol extract

代表性样品对病原菌运动性和苏鼠李糖脂合成基因的抑制作用(见图2)。左右图为同一个平板在白光下的照片和自身发光照片。报道菌体涂布在整个平板上，基因表达水平由菌体发光强度(明暗度)表示。3种中药(爵床科植物、败酱科植物和萝藦科植物) 提取物所在滤纸片的周围发光明显降低 (右图)，表明3种中药对rhlA有抑制，且它们对细菌生长没有影响，无抑菌圈(左图)。白头翁与仙鹤草的提取物可以明显抑制铜绿假单胞菌的泳动能力，大青叶的提取物对泳动没有影响(左图)。黄连的提取物则可以明显抑制铜绿假单胞菌的丛动能力(右图)。

图2铜绿假单孢菌致病因子基因rhlA表达和运动性受中药粗提物的抑制A：rhlA表达受中药粗提物的抑制，1：爵床科植物提取物；2：败酱科植物提取物；3：萝藦科植物提取物；B：运动性受中药粗提物的抑制，Sample 5：白头翁提取物；Sample 52：仙鹤草提取物；Sample 23：大青叶提取物；Sample 2：黄连Fig.2 The herbs extract suppress the expression of rhlA and the motility of Pseudomonas aeruginosaA: The herbs extract suppress the expression of rhlA.1: Acanthaceae extracts; 2: Valerianaceae extracts ; 3: Asclepiadaceaeextracts.B:The herbs extract suppress the motility.Sample 5: Pulsatilla chinensis(Bge.)Regel extract; Sample of 52: Agrimonia Pilosa Ledeb.extract; Sample 23: Isatis indigotica Fort.extract; Sample 2: Coptis chinensis Franch extract

在筛选中，发现约60%的中药材的提取物含有效抗致病成分，阳性率似乎高得不同寻常。但是考虑到所选中药材都是具有抗感染、消炎作用，成分来源是经过长期临床验证了的有效中药，这提示了中药中某些成分尚未发现的抗致病效用可能相当普遍。

总之，清热解毒中药普遍存在抗致病因子或抑制群体感应作用的成分，其作用也许是这类中药真正的抗感染药效机理。同时应当注意的是，有些中药成分对病原菌的致病因子或其调节因子具有促进作用，因而可能会在体内对病原菌感染的控制起负作用。因此，甄别中药的有效成分，选择利用真正的“抗致病”成分极为重要。

3 中药抗细菌感染成分的研究展望

针对病原菌致病因子的“抗致病药物”是当前抗生素研究的新理念、新范式(paradigm)。传统抗生素杀灭细菌的这一策略从根本上存在问题。病原微生物是繁殖快、易突变、变化复杂的生物，注定会逃脱抗生素等对其生存构成的压力。任何以杀灭活性、抑制生长为作用方式的药物最终都将导致病原菌对其产生抗药性[2]。2001年第一个进入临床使用的Oxazolidinone 类抗生素 Linezolid, 在2002年已有抗药性菌株出现。相反，针对致病性的新型抗感染药物却呈现不同的景象。针对致病因子纤毛的抑制物(称作pilicides)成功地阻止了泌尿系统致病菌的附着及生物膜形成[18]，证明此类“抗致病药物”具有巨大的应用前景。

中药中存在大量抗铜绿假单胞菌致病药物成分的实验结果表明，中药中某些成分尚未发现的抗致病效用可能相当普遍。抑制致病因子表达从而控制感染，对于病原菌来说，不像有杀菌、抑菌作用的传统抗生素那样有生存压力，因此抗性产生的几率相对较小。人们普遍认为的“中药不易形成抗药性”，这也许是一个事实，一个由其特殊作用机理决定的特性。鉴于这一类新型抗细菌感染药物的特殊作用机理，这类新型抗致病药物相对传统抗生素具有极大的潜力优势。

以中药为资源，研究开发新型抗生素或抗致病药物，还需要结合新的技术和方法。发现新的抗生素的传统方法是利用整体病原菌细胞筛选对其生长有抑制的物质。这一方法的优点是筛选到的活性物质都可以进入细胞，但这种方法灵敏度低，要求所筛选的有效物质在样品中的浓度要大，低浓度的有效物往往被漏掉。而近些年使用的体外靶点筛选法以微生物生命活动中重要的酶等为作用靶点，体外筛选有针对性的抑制剂等，这一方法有高灵敏度的优点，但许多在体外靶点所研究出的抗生素物质由于不能进入细胞而往往在体内(invivo)试验中失败。胞内靶点的方法可以结合二者的优势。以荧光素酶基因为标记的报道子和荧光蛋白为标记的报道子可以用来建立致病因子基因报道体，具有实时、定量、简便等特点，是近年来使用较多的方法。随着技术发展，相信更好、更多的新方法将为研究中药抗细菌感染成分提供选择。

最后，抗致病药物由于其特性的限制，并不会取代以抑菌、杀菌为目的的传统抗生素。对某些细菌感染比如菌血症，传统抗生素的使用也许更有优势，因为这种情况下快速清除病原菌极为重要。在未来，由现代方法技术和创新性思维研制的、来源于中药的抗致病药物将很可能和传统抗生素一起，共同成为人类抵御细菌感染的有效武器。

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(编校：王俨俨)

Perspectives on antibacterial activities of traditional Chinese medicine and its potential mechanisms

YANG Sai, GUO Qiao, DUAN Kang-minΔ

(College of Life Science and Technology, Northwest University, Key Laboratory of Resources Biotechnology in Western China, Ministry of Education, Xi’an 710069, China)

The discovery and use of antibiotics is one of the most important breakthroughs in medical history.However, the uprising and spread of the drug-resistance bacterial pathogens have posed a great threat on human health once again.There is an urgent need to develop new antibiotics.Traditional Chinese medicine contains a large volume of bioactive substances suited for novel antibiotic development.However, clinical use of antibiotics of Chinese medicine originis are very rare despite the fact that Chinese medicine has been used for infectious diseases for many years.In this paper, we propose a new mechanism of action for Chinese medicine in treating infectious diseases based on our experimental data.Unlike conventional antibiotics which kill pathogens or inhibit their growth, the traditional Chinese medicine probably function through repressing bacterial pathogenicity.That is, they are actually “antipathogenic drugs”.There are several advantages these antipathogenic drugs possess over traditional antibiotics, including that pathogens are less likely to develop resistance and the drugs have less effect on normal members of the human microbe.

Chinese herbs; disease-causing agents; antibiotics; pathogenic bacteria; drug target

国家自然科学基金(31570131)；中国博士后科学基金(2014M562444)

杨赛，男，硕士，研究方向：铜绿假单胞菌致病性以及耐药性研究，E-mail:1127207674@qq.com；段康民，通信作者，男，博士，教授，研究方向：微生物群体间的信号传递、病原菌致病机理、新抗菌靶点和中药及天然产物中新型抗生素筛选，E-mail：kduan@nwu.edu.cn。

R259；R51

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.04