刺络泻血对原发性肝癌大鼠血清AFP、SF的影响

吴　云　赵慧玲　刘新燕　魏　珂　陈子晨　谭　丽　战慧敏

(1 北京中医药大学针灸推拿学院，北京，100029； 2 丰台中西医结合医院，北京,100072)



实验研究

刺络泻血对原发性肝癌大鼠血清AFP、SF的影响

吴云1赵慧玲1刘新燕1魏珂2陈子晨1谭丽1战慧敏1

(1 北京中医药大学针灸推拿学院，北京，100029； 2 丰台中西医结合医院，北京,100072)

摘要目的：观察刺络泻血对原发性肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)模型大鼠甲胎蛋白(Alpha-Fetoprotein，AFP)、铁蛋白(Serum Ferritsn，SF)及肝功能相关指标的影响，探究刺络泻血对HCC的预防作用及相关机制。方法：将40只健康Wistar大鼠随机分为正常对照组(10只)、模型组(15只)、刺血预防组(15只)。除正常对照组外，其余两组均采用二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine，DEN)腹腔注射建立HCC模型，刺血预防组在造模开始同时取肝经浅表络脉刺血，0.5 mL/次，2次/周，至13周。第13周末，腹主动脉取血5 mL，采用ELESA法测定3组大鼠血清肝功能丙氨酸氨基转移酶(Alamine Aminotransferase，ALT)、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)、谷氨酰转肽酶(Gamma Glutamyl Transpeptidase，GGT)和肿瘤标志物AFP、SF含量。结果：与正常对照组比较，模型组大鼠血清ALT、ALP、GGT、AFP、SF含量均明显升高(P<0.05)，差异具有统计学意义。与模型组比较，刺血预防组大鼠血清ALT、ALP、GGT、AFP、SF含量均降低(P<0.05)，差异有统计学意义。结论：刺络泻血疗法对HCC的发展有一定程度的抑制作用，其作用机制可能与降低血清肝功能指标，保护肝脏，下调肿瘤标志物AFP、SF水平有关。

关键词刺络泻血；原发性肝癌；甲胎蛋白；铁蛋白；大鼠

原发性肝癌是指肝细胞或肝内胆管细胞发生的癌肿，该病一般起病隐匿，发展迅速，且致死率高，因此有“癌中之王”之称[1]。目前临床上针对HCC的治疗西医主要采用手术切除或放、化疗法，价格昂贵且不良反应较大，近年来研究显示，中医针灸在防治HCC方面有很好的疗效[2-5]。刺络泻血作为针灸疗法的一种，系通过三棱针或其他针具刺破人体血络或腧穴，放出适量血液，以治疗或防治疾病的方法，拥有上千年历史，近年来在肝病防治方面，取得了一定进展，日益受到国内外的广泛关注。

研究表明[6]，刺络泻血疗法具有祛瘀生新、清热解毒、消癥散结等作用，可以有效降低血清肝功及肝纤四样的含量，促进肝星状细胞凋亡，防治肝纤维化，而肝纤维化是肝癌癌前病变[7]，本研究拟建立DEN诱发大鼠肝癌模型，观察肝经浅表络脉刺血对肝功ALT、AST、GGT，及肿瘤标志物AFP、SF的影响，初步探究刺络泻血对HCC的预防作用及相关机制。

1材料与方法

1.1实验动物及分组清洁级雄性Wistar大鼠40只，体重(200±10)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。许可证号:SCXK(京)2012-0001。于室温22 ℃，相对湿度45 %清洁条件下适应性喂养7 d后，采用随机数字表将大鼠分为3组，即A.正常对照组10只；B.模型组15只；C.刺血预防组15只，实验过程符合实验动物伦理学相关规定。

1.2主要试剂DEN(美国Sigma公司，批号:Sigma-N0756)；ALT、ALP、GGT测定试剂盒(北京环宇金科生物医学技术有限公司)；10%水合氯醛(北京中医药大学实验室配制)；4%多聚甲醛溶液(北京百诺威生物科技有限公司)。

1.3实验方法

1.3.1造模方法采用改良型DEN诱导的原发性肝癌大鼠模型[8]，将剂量为50 mg/kg的DEN溶于100 mg/kg生理盐水中，配置成浓度为50.00 mg/kg的溶液，每次腹腔注射前进行大鼠体重测量，以确定注射量，2次/周，每次间隔3～4 d(约84 h)，连续4周后改为1次/周，以保证大鼠生存率，连续13周诱癌成功。造模成功指征：造模大鼠出现精神萎靡，毛发黄，体重减轻，鼻腔出血、贫血、尿血、肠胀气、腹水等并发症，解剖肉眼观察肝脏形态出现质地变硬，萎缩变小，表面出现大小不一的结节；肝脏组织病理切片显示肝细胞深染、细胞核多形、肿瘤灶诱导形成。

1.3.2干预方法刺血预防组在造模开始同时，取后肢肝经浅表络脉刺血，75%乙醇消毒。持针法：拇、食指持针，中指抵住针尖上方，一是控制针刺方向，二是控制针刺深度；进针法：小号三棱针直刺进针，迅速出针，以出血为度；出血量：少量，两穴总计0.5 mL，3次/周。模型组腹腔注射DEN，正常组同一部位注射生理盐水，3组予相同时间相同方法抓取固定。

1.3.3标本采集与检测13周后，各组大鼠禁食、不禁水12 h，10 %水合氯醛麻醉，腹主动脉取血5 mL，静置离心(4 ℃，3 500 r/min，10 min)后取上层血清送肝功及相关肿瘤标志物指标检测，采用ELISA法测定。脱颈、开腹，观察记录各组肝脏的形态、颜色、质地。取肝组织用4%多聚甲醛缓冲液固定24 h，常规石蜡包埋，切片，HE染色。

2结果

2.1各组大鼠血清肝功能ALT、ALP、GGT比较与正常对照组相比，模型组大鼠血清ALT、ALP、GGT含量显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，刺血预防组大鼠血清ALT、ALP、GGT含量均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　各组大鼠血清肝功能指标比较±s)

注:与正常对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

图1　各组大鼠血清肝功能指标比较

2.2各组大鼠血清肿瘤标志物AFP、SF比较与正常对照组相比，模型组大鼠血清AFP、SF含量显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，刺血预防组大鼠血清AFP、SF含量均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

3讨论

中医以辨证论治为核心，是目前治疗HCC的重要方法之一，将其与手术，放、化疗有机结合，有助于减少放、化疗的毒副反应，稳定病情，提高生存质量。此外，中医提倡未病先防，既病防变，其重在调体，在癌症的预防和抗复发方面优势亦显著。HCC可归属于中医“胁痛、积聚、鼓胀”等范畴，其基本病理变化为正气不足，气滞、血瘀、痰结、湿聚、热毒等相互胶着，日久渐积成块。而“久病必瘀”，瘀血贯穿肝癌发病始终，本虚标实是其基本病机[9]。张从正认为：“出血者，乃所以养血也”，泻血即为扶正，瘀血不除，新血难生，刺血疗法可以祛瘀生新,祛邪扶正，正好针对原发性肝癌的病因病机。

表2　各组大鼠血清肿瘤标志物指标比较±s)

注:与正常对照组比较,**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

图2　各组大鼠血清肿瘤标志物指标比较

按照世界卫生组织关于疾病和有关健康问题的国际统计分类(ICD10)对疾病的分类，发现刺血疗法适宜病种共涉及18大类系统，262个病种。其中包括“癥瘕”“积聚”，而原发性肝癌属于中医学“癥瘕”“积聚”范畴，所以可以认为是刺血疗法的适应证之一。刺血治疗肿瘤病，早在《黄帝内经》年代就有记载，《灵枢?九针论》曰：“八风之客于经络之中，为瘤病者也，故为之治针，必甬其身而锋其末，令可以泻热出血而癌病竭”。

AFP、SF等是当前HCC实验室诊断常用指标[10-11]，AFP被认为是HCC诊断和预后的首选标志物[12]。SF为第二肝癌肿瘤标志物，特别是对AFP阴性者[13]。SF在肝脏合成，肝病肝细胞受损，清除SF障碍，或癌细胞合成SF量增加，均可导致血清SF高浓度表达[14-15]。本研究结果显示，相较正常对照组，模型组与预防组大鼠AFP、SF含量均有不同程度升高，说明两组大鼠肝脏都存在不同程度的恶变；但与模型组比较，刺血预防组AFP、SF水平均显著降低，且差异有统计学意义，提示刺络泻血在一定程度上起到了有效减轻并预防肝癌发生发展的作用，其机制可能与降低AFP、SF含量，祛瘀生新，促使癌毒及代谢产物排泄有关。ALT、ALP、GGT最能反映肝细胞受损程度，是目前最常用的肝功能指标,血清GGT主要来源于肝脏，具有癌胚蛋白的性质，与AFP联合检测对HCC早期诊断具有较高的准确性[16-17]。本实验采用几项指标联合检测方法，可有效提高诊断灵敏度，减少单一检测漏诊率。

现代医学研究表明，刺络放血可使瘀滞在局部的病理性产物得以清除，改善微循环障碍，保护肝脏，提高机体免疫力，缓解疼痛[18]。田叶红[19]等采用刺血拔罐治疗癌性不全性肠梗阻21例，有效率达71.4%。本研究结果也显示刺络泻血疗法可使侵入机体的毒邪随血排出，通过祛瘀生新，理血调气，调节脏腑功能，激发机体免疫力，从而抑制毒邪的扩展与再生，一定程度上降低肿瘤标志物相关指标，保护肝脏，对HCC发生发展起到预防并延缓的作用。刺络泻血疗法是一种天然针刺疗法，因其“简、便、廉、验”的特点而应用于临床各个系统百余种疾病的防治和保健[20-22]，值得进一步继承和发展，但刺络泻血疗法的操作方法缺乏统一规范，其作用机理仍待深入探讨。

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(2015-12-05收稿责任编辑：张文婷)

Research on the Influence of Pricking Blood on Colleterals Therapy on Serum AFP and SF in the Rat Model of Primary Liver Cancer

Wu Yun1,Zhao Huiling1,Liu Xinyan1,Wei Ke2,Chen Zichen1,Tan Li1,Zhan Huimin1

(1SchoolofAcupuncture-MoxibustionandTuina,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China;2FengtaiIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicineHospital,Beijing100072,China)

AbstractObjective:To observe the effect of pricking blood on colleterals therapy on AFP and SF in rats model of primary liver cancer (HCC),and explore its preventive effect and related mechanism.Methods:Forty healthy Wistar rats were randomly divided into control group (n=10),model group (n=15) and pricking blood group (n=15).In addition to the control group,the other two groups were injected with DEN (Diethylnitrosamine) intraperitoneally to establish liver cancer model.Rats in pricking blood group was performed of blood letting on the superficial veins of hind leg along the liver meridian,0.5 mL each time and 2 times per week,till the eighteenth week.At the end of the week,taking 5 mL blood from the abdominal aorta and using ELESA method to determine ALT (Alamine Amino Transferase),ALP (Alkaline Phosphatase),GGT (Gamma Glutamyl Transpeptidase),AFP and SF levels in serum.Results:Compared with the control group,the serum levels of ALT,ALP,GGT,AFP and SF in model group were significantly increased,and the difference was statistically significant (P<0.05).Compared with the model group,the serum levels of ALT,ALP,GGT,AFP and SF in the prevention group were lower,and the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion:Blood pricking on colleterals therapy has inhibitory effect on HCC,which might due to the fact that it can decrease the liver serum levels and tumor signals AFP and SF.

Key WordsBlood pricking on colleterals therapy; Primary liver cancer; AFP; SF; Rats

作者简介:吴云(1988.11—)，女，硕士，北京中医药大学，研究方向：刺络泻血疗法作用机理研究，E-mail：1002375051@qq.com 通信作者：赵慧玲(1957.7—)，女，主任医师，教授，北京中医药大学，研究方向：刺络泻血疗法的文献、实验及临床研究，E-mail：zhaohuiling3895@sohu.com

中图分类号：R245

文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.06.032