双分子荧光互补技术(BiFC)分析玉米MAPK5与bZIP72蛋白的相互作用

曹建美

(中国科学院上海辰山植物研究中心，上海辰山植物园，上海松江 201602)



双分子荧光互补技术(BiFC)分析玉米MAPK5与bZIP72蛋白的相互作用

曹建美

(中国科学院上海辰山植物研究中心，上海辰山植物园，上海松江 201602)

摘要[目的]分析玉米MAPK5与bZIP72蛋白之间的相互作用。[方法]构建双分子荧光互补表达载体pN-MAPK5和pC-bZIP72，应用基因枪轰击洋葱表皮细胞瞬时表达，在激光共聚焦显微镜下观察MAPK5与bZIP72蛋白相互作用产生的荧光信号。[结果]ZmMAPK5与ZmbZIP72的BiFC融合载体同时轰击洋葱表皮细胞，细胞核中能发出黄色荧光。[结论] ZmMAPK5与ZmbZIP72在植物细胞核内相互作用。

关键词ZmMAPK5；ZmbZIP72；双分子荧光互补(BiFC)；蛋白互作

植物作为固着生物，在长期的进化过程中发展出复杂的信号响应系统来增强自身对各种不利环境条件的抵抗。其中，最保守的信号系统即为MAPK 信号级联系统，它通过一系列的磷酸化作用将胞外刺激信号转导到胞内，保护细胞免受胁迫伤害。典型的MAPK信号转导系统为三级磷酸化传递系统[1]。MAPKKK接受生物的或非生物的刺激，通过2次磷酸化过程将刺激信号逐级放大传递给MAPK，MAPK接收到信号后可能有3种反应[2]：继续停留在细胞质中激活其他蛋白激酶；进入细胞核，与转录因子相互作用，调控转录因子活性；在细胞质中使细胞骨架磷酸化。

转录因子(Transcription factors, TFs)也称反式作用因子，能够与真核基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性相互作用，并对转录有激活或抑制作用。植物转录因子基因家族中研究最多的一类是碱性亮氨酸拉链(basic region/leucine zipper motif, bZIP)类转录因子。植物bZIP转录因子含有60～80个氨基酸残基，由一个二聚化作用的亮氨酸拉链区域和一个DNA结合的碱性结构域组成。研究表明，植物bZIP转录因子在细胞中主要定位于细胞核。bZIP转录因子家族成员在植物中有的呈组成型表达，有的呈器官特异性表达，有的呈发育相关性表达，有的受各种非生物胁迫，包括盐害、冷害、干旱等诱导表达。除转录水平上受诱导表达调控活性外，植物bZIP转录因子在转录后水平上也被调控，包括磷酸化调控、二聚化调控和蛋白蛋白相互作用等[3]。这些调控方式可以改变转录因子对顺式元件结合的亲和力，从而增强或减弱转录因子的转录调控活性。

玉米(Zeamays)是重要的粮食作物和工业生产原料，环境非生物胁迫因子如干旱、高盐等严重影响玉米的生长发育。因此，研究其逆境响应机制，对提高玉米产量和质量具有重要意义。目前，玉米中关于MAPK蛋白激酶与bZIP转录因子之间相互作用的研究鲜见报道。笔者根据玉米MAPK5和bZIP72基因序列设计特异性引物，从玉米叶片cDNA中扩增ZmMAPK5和ZmbZIP72的CDS片段，分别构建ZmMAPK5与ZmbZIP72的BiFC融合载体，基因枪轰击洋葱表皮细胞瞬时表达分析ZmMAPK5与ZmbZIP72的蛋白相互作用。

1材料与方法

1.1植物材料以玉米(ZeamaysL.)杂交种农大108为试验材料。选取饱满一致的玉米种子，浸泡过夜，25 ℃催芽48 h，挑选发芽一致的种粒播种于石英砂中，置于光照培养箱(28 ℃、RH 90%、光照16 h/d)中生长。待幼苗第2叶完全展开，取叶片液氮速冻备用。新鲜的洋葱，撕表皮待用。

1.2菌株、载体和酶类E.coli菌株(DH5α)、BiFC载体(pUC19-N，pUC19-C)由中国科学院辰山植物研究中心保存；pMD19-T载体、限制性内切酶、T4连接酶、Trizol等购自宝生物大连有限公司(TaKaRa);KOD购自TOYOBO公司；DNA质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程公司；引物合成和测序由上海生工生物工程公司完成。

1.3方法

1.3.1玉米MAPK5和bZIP72基因克隆。采用Trizol方法提取玉米叶片总RNA，反转录成cDNA为模板，根据ZmMAPK5和ZmbZIP72基因序列通过Primer 5.0设计相应的引物进行PCR扩增。ZmMAPK5上游引物F1：5′-ATGATTTTATTTTGACTGAT-3′,下游引物F2：5′-CTACTGATAATCAGGGTTGA-3′；ZmbZIP72上游引物F3：5′-ATGGACGAGCTGCTCCAGA-3′,下游引物F4：5′-ATGGACGAGCTGCTCCAGA-3′。PCR扩增条件：预变性94 ℃ 2 min；98 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 30 min加A尾。扩增的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收连接到pMD19-T载体，由上海生工生物工程有限公司测序，测序结果比对正确的阳性质粒待用。

1.3.2BiFC融合载体的构建及鉴定。通过分析ZmMAPK5和ZmbZIP72基因序列上的克隆位点，在上下游引物中分别添加HindIII和BamHI以及XbaⅠ和SmaⅠ酶切位点，以连入目的基因的T载体质粒为模板进行PCR扩增。PCR产物和BiFC载体经相应的内切酶双酶切后回收，回收产物用T4连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌落PCR初步验证挑取阳性单菌落提取质粒，进一步用相应的内切酶酶切鉴定，鉴定成功的克隆送上海生工生物工程有限公司测序。构建成功的载体分别命名为pN-MAPK5、pC-bZIP72。

1.3.3基因枪轰击洋葱表皮细胞瞬时表达。在超净工作台中，将洋葱剥去外表皮后，取第4层鳞茎切成2 cm × 2 cm的方块，撕下内表皮贴在灭好菌的2%琼脂糖培养基上，尽可能减少气泡，待用。取7.5 μL金粉悬液于Eppendorf管，依次加入1 μL质粒DNA(1 μg/μL)，15 μL 2.5 mol/L CaCl2和6 μL 0.1 mol/L亚精胺。振荡3 min，冰上静置10 s，10 000 r/min离心10～20 s，弃上清。加80 μL无水乙醇，振荡重悬，10 000 r/min离心10～20 s，弃上清。用10 μL无水乙醇重悬，待用。将压力膜和轰击膜在70%乙醇中浸泡10 min后取出，在超净工作台上晾干；金属挡板用70%乙醇清洗晾干。将10 μL无水乙醇重悬的金粉-DNA复合体均匀涂布于轰击膜的中间位置，晾干，安装到发射装置上。将可裂膜安装到气体加速管的下端，洋葱表皮集中于培养皿的中部，放入真空室内，取下培养皿盖。抽真空指针到所需值(27 in，Hg)，放氦气于气体加速管，直至管中压力达到可裂圆片所能承受的压力时，可裂膜破开，气体冲至轰击膜上，金属颗粒透过金属挡板的网孔射向洋葱细胞，可裂膜压力为1 100 psi。轰击完的洋葱细胞25 ℃培养24 h后用激光共聚焦显微镜(LSM 510 META)观察，黄色荧光蛋白(Yellow Fluorescent Protein, YFP)最适激发光波长490 nm，发射光波长515 nm。

2结果与分析

2.1玉米MAPK5和bZIP72基因的克隆以反转录的玉米叶片cDNA为模板，用相应的引物进行PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，分别得到1 200和890 bp的特异性条带(图1)，与ZmMAPK5和ZmbZIP72预期的CDS序列大小一致。用凝胶回收试剂盒分别回收，将回收的目的条带连接到克隆载体pMD19-T上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经菌落PCR验证后挑取阳性单菌落提取质粒，由上海生工生物工程有限公司测序，测序结果通过BLAST比对证实，扩增序列与ZmMAPK5和ZmbZIP72的基因序列完全一致。

2.2BiFC融合载体的构建及验证ZmMAPK5和ZmbZIP72基因扩增的片段经HindⅢ+BamHⅠ、XbaⅠ+SmaⅠ双酶切后，分别连接至同样经HindⅢ+BamHⅠ、XbaⅠ+SmaⅠ双酶切的BiFC载体pUC19-N和pUC19-C上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌落PCR验证后挑取阳性单菌落提取质粒，经双酶切鉴定，ZmMAPK5条带约为1 200 bp，ZmbZIP72条带约为890 bp，与预期结果一致(图2)。测序结果通过BLAST比对与NCBI报道的序列完全一致，表明重组质粒pN-MAPK5和pC-bZIP72融合表达载体构建成功。

注：A中M.DNA Marker，Marker III, 1. ZmMAPK5 (1 200 bp); B中M.DNA Marker，DL2 000; 1.ZmbZIP72(890 bp)。Note:As for A, M.DNA Marker, MarkerIII; 1.ZmMAPK5 (1 200 bp); As for B, M.DNA Marker; DL2000; 1.ZmbZIP72 (890 bp).图1　ZmMAPK5和ZmbZIP72基因的PCR扩增Fig.1　PCR products of ZmMAPK5 and ZmbZIP72 genes

注：A中M.DNA Marker，Trans 2K plus DNA Marker, 1.重组质粒pN-MAPK5双酶切结果(HindⅢ+ BamHⅠ); B中M.Trans 2K plus DNA Marker, 1.重组质粒pC-bZIP72双酶切结果(XbaⅠ+ SmaⅠ)。Note: As for A, M.DNA Marker, Trans 2K plus DNA Marker; 1.Identification of recombinant plasmid of N-MAPK5by HindⅢ+ BamHⅠ; As for B, M.Trans 2K plus DNA Marker; 1.Identification of recombinant plasmid ofC-bZIP72by XbaⅠ+ SmaⅠ.图2　BiFC融合表达载体pN-MAPK5和pC-bZIP72酶切鉴定Fig.2　Enzyme cut products of N-MAPK5 and C-bZIP72 plasmids

2.3BiFC检测ZmMAPK5和ZmbZIP72蛋白相互作用将构建好的BiFC融合载体pN-MAPK5和pC-bZIP72利用基因枪轰击至洋葱下表皮细胞中，25 ℃培养16 h后用激光共聚焦显微镜观察黄色荧光信号，设置pN-MAPK5和pC-ABA2为阳性对照；pN-MAPK5和pC-bZIP71为阴性对照。结果显示，在激光共聚焦显微镜下阴性对照无荧光信号，阳性对照MAPK5和ABA2在整个细胞质中均检测到黄色荧光信号，而MAPK5和bZIP72仅在细胞核中检测到黄色荧光信号(图3)。说明ZmMAPK5和ZmbZIP72在植物体内存在蛋白互作，且相互作用发生在细胞核中。

注：A试验组(pN-MAPK5和pC-bZIP72)的洋葱表皮细胞，1.明场，2.黄色荧光蛋白激发荧光；3.1和2叠合；bar=150 μm; B阴性对照(pN-MAPK5和pC-bZIP71)的洋葱表皮细胞，1.明场，2.无黄色荧光，3.1和2叠合，bar=150 μm; C阳性对照(pN-MAPK5和pC-ABA2)的洋葱表皮细胞，1.明场，2.黄色荧光蛋白激发荧光，3.1和2叠合，bar=75 μm。Note:A Experiment groups (pN-MAPK5 and pC-bZIP72)of bombarding onion epidermal cells:1.Light; 2.Fluorescence; 3.Merge; bar=150 μm;BNegative control (pN-MAPK5 and pC-bZIP71)of bombarding onion epidermal cells:1.Light; 2.Fluorescence; 3.Merge; bar = 150 μm;B Positive control(pN-MAPK5 and pC-ABA2)of bombarding onion epidermal cells:1.Light; 2. Fluorescence; 3.Merge; bar = 75 μm.图3　ZmMAPK5和ZmbZIP72在洋葱表皮细胞中互作的BiFC检测Fig.3　BiFC assay of ZmMAPK5 and ZmbZIP72 in onion epidermal cells

3结论与讨论

研究表明，玉米MAPK5参与ABA诱导的抗氧化防护且可增强植物对干旱、高盐以及氧化胁迫等逆境的耐受性[4-5]。玉米bZIP72蛋白是ABA依赖的逆境响应途径的转录激活子，且bZIP72蛋白的活性可能受到转录后调控。Ying等[6]研究玉米SAPK8调控bZIP72蛋白时发现两者之间无相互作用。玉米MAPK5能否调控bZIP72是该研究的重点。

BiFC技术是研究蛋白质相互作用的最直观方法，该技术将2个蛋白分别连到YFP截断的N末端(YN，1～173)和C末端(CN，173～238)，当这2个蛋白相互作用靠近时，YFP截断的N末端和C末端便形成完整的YFP发出黄色荧光，这个系统最初被应用在动物细胞中研究蛋白之间的相互作用[7-8]。随着瞬时表达的建立，结合BiFC技术相继建立了原生质体的BiFC系统研究植物中蛋白之间的相互作用[9-11]。Xu等[12]利用拟南芥原生质体的BiFC系统证实了CIPK23与CBL1、CBL9，CIPK23与AKT1在拟南芥原生质体中相互作用调控K+的吸收，作用位置均在细胞膜上。该研究构建了ZmMAPK5和ZmbZIP72荧光表达载体，以已知有相互作用的pN-MAPK5和pC-ABA2为阳性对照,充分说明两者在细胞内相互作用。

该研究成功建立了基因枪轰击洋葱表皮细胞瞬时表达

体系，结合BiFC技术发现ZmMAPK5和ZmbZIP72在植物体内存在蛋白互作，且相互作用发生在细胞核中。该研究结果为MAPK在玉米逆境胁迫响应途径中的机理研究提供了思路。

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作者简介曹建美(1985- )，女，江苏金坛人，工程师，博士，从事植物抗逆研究。

收稿日期2016-04-10

中图分类号S 188+.2

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)14-152-03

Interaction Between MAPK5 and bZIP72 of Maize Using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay

CAO Jian-mei

(Shanghai Chenshan Plant Science Research Center, Chinese Academy of Science, Shanghai Chenshan Botanical Garden, Shanghai 201602)

Abstract[Objective] To analyze the interaction between MAPK5 and bZIP72.[Method] Two BiFc plasmids (pN-MAPK5 and pC-bZIP72) were constructed, then transfected into onion epidermal cells via gene-gun approach.The interaction between MAPK5 and bZIP72 was examined by confocal laser scanning microscopy.[Result] Yellow fluorescence was observed in the onion epidermal cells transfected with ZmMAPK5 and ZmbZIP72.[Conclusion] This research indicates that ZmMAPK5 and ZmbZIP72 interacts with each other in vivo.

Key wordsZmMAPK5; ZmbZIP72; Bimolecular fluorescence complementation (BiFC); Protein interaction